趙夢秋，鄭書國，楊解人，姚 海，王 歡，李 偉，宣佳利，張俊秀

(皖南醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

D-半乳糖可引起肝損傷，可用于建立肝損傷動物模型[1]。一方面，它作為肝細胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑，競爭性生成二磷酸尿苷半乳糖復(fù)合物，使磷酸尿苷耗竭，導(dǎo)致物質(zhì)代謝障礙；另一方面，通過加速自由基生成，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[2]。鋁是我們生活中經(jīng)常會接觸到的一種慢性蓄積性毒性金屬元素，尤其因為國人的飲食習(xí)慣，如油條、蛋糕、膨化食品以及各種鋁制品的使用會導(dǎo)致鋁攝入超標，大量研究表明鋁對機體的損害與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強有關(guān)。鋁中毒對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性已被許多研究所證實，其對于肝臟損傷亦有報道[3-5]，因此本實驗使用肝損傷誘導(dǎo)劑D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁，復(fù)制肝損傷模型。

芝麻素是芝麻中主要活性成分，具有較強抗氧化活性，能降低NAPDH氧化酶的表達[6]，同時提高SOD的活性[7]，對氧化應(yīng)激相關(guān)性疾病具有明顯防治作用[8-9]。前期研究發(fā)現(xiàn)芝麻素與維生素E聯(lián)用時具有協(xié)同作用[10]。本實驗通過連續(xù)灌胃給予三氯化鋁聯(lián)合腹腔注射D-半乳糖法建立大鼠肝損傷模型，觀察芝麻素及其與維生素E聯(lián)用對肝損傷的保護作用并初步探討其可能機制，為臨床應(yīng)用芝麻素防治肝損傷提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件 清潔級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，雌雄各半。許可證號：SCXK(蘇)2009-0002，購于蘇州大學(xué)實驗動物中心。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠一只，自然光照，室溫(23±2)℃，相對濕度60%～65%，自由進食和飲水。

1.2 主要藥物 芝麻素(sesamin，Ses)，純度93.7%，上海純優(yōu)生物科技有限公司；維生素E，北大國際醫(yī)院集團西南合成制藥股份有限公司；三氯化鋁(AlCl3)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；D-半乳糖(D-gal)，Reanta Scientific Technology company；戊巴比妥鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要試劑 HE和Masson染色試劑:蘇木精，伊紅。Masson:染液試劑盒，南京建成生物工程研究所；免疫組化試劑:iNOS(誘導(dǎo)性一氧化氮合酶)抗體，二抗，封閉液，三抗試劑盒，DAB顯色液，武漢博士德生物工程有限公司；T-AOC(總抗氧化能力)、SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)試劑盒，南京建成生物工程研究所；NO(一氧化氮)檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 動物分組及給藥方法 30只大鼠隨機分為正常對照組、肝損傷模型組、芝麻素(Ses)組、芝麻素維生素E聯(lián)用組和維生素E組。除正常組外，其余各組大鼠采用D-gal[180 mg/(kg·d)]腹腔注射聯(lián)合AlCl3[15 mg/(kg·d)]灌胃建立肝損傷大鼠模型，共12周。13周起各給藥組分別灌胃給予芝麻素[160 mg/(kg·d)]、維生素E[10 mg/(kg·d)]，聯(lián)用組給予芝麻素以及維生素E[160 mg/(kg·d)+10 mg/(kg·d)]共8周。正常對照組灌胃給予等容量0.5%羧甲基纖維素鈉。期間每周稱重一次，調(diào)整給藥劑量。

2.2 肝臟組織HE及Masson染色 各組大鼠肝臟多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制成石蠟切片(5 μm)，切片常規(guī)脫蠟至水。HE染色，光鏡下觀察肝臟病理學(xué)變化。Masson染色步驟如下：石蠟切片脫蠟至水后，30～40 ℃溫熱水漂洗，每次60 s，共2次；核染液染色20 s，棄染色液，沖洗液沖洗30 s；漿染液染色30 s，棄染色液，沖洗液沖洗30 s；黃色分色液分色6 min，棄分色液；直接用藍色復(fù)染液染色3 min，棄染色液，用無水乙醇沖洗干凈；吹干后，封片，光鏡下觀察膠原纖維增生情況。

2.3 生化指標檢測 肝臟用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，濾紙拭干，稱濕質(zhì)量后計算肝臟質(zhì)量指數(shù)(肝臟濕質(zhì)量/體質(zhì)量)。稱取0.1 g肝臟，制備10%組織勻漿，再以3 000 r/min離心10 min，取上清液(按照試劑盒說明書進行操作)檢測T-AOC、SOD、MDA及NO。

2.4 肝臟組織iNOS蛋白表達檢測 采用免疫組織化學(xué)方法，常規(guī)石蠟切片(5 μm)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶后浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，微波熱抗原修復(fù)，冷卻后封閉。滴加一抗iNOS抗體(1∶150)，4 ℃冰箱過夜后依次滴加二抗，SABC，PBS洗3次，DAB顯色。常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察，iNOS陽性產(chǎn)物呈棕黃色。應(yīng)用Image-pro plus 5.0型全自動醫(yī)學(xué)圖像彩色分析系統(tǒng)進行圖像半定量分析。每個標本選取6張切片，相同放大倍數(shù)下測定肝組織中陽性表達的棕黃色顆粒面積(Area)和累計光密度(IOD)，計算出平均光密度值(AIOD)值。

3 結(jié)果

3.1 芝麻素對大鼠一般狀況的影響 正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)敏捷，毛色有光澤，飲食、飲水均正常，且無死亡現(xiàn)象發(fā)生；肝臟損傷模型組大鼠精神萎靡不振，反應(yīng)遲鈍，神情呆滯，毛發(fā)豎直無光澤，給予芝麻素和維生素E治療后，大鼠上述癥狀均有不同程度緩解。造模前各組大鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，實驗結(jié)束時模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)；藥物治療對體質(zhì)量減輕的影響無顯著性差異(表1)。

3.2 芝麻素對大鼠肝臟濕質(zhì)量及肝臟質(zhì)量指數(shù)的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠肝臟濕質(zhì)量降低(P<0.01)；藥物治療對肝臟濕質(zhì)量及肝臟質(zhì)量指數(shù)無顯著影響(表1)。

3.3 芝麻素對大鼠肝臟病理學(xué)改變的影響 HE染色結(jié)果顯示，正常肝細胞呈條索狀排列，規(guī)則有序，胞漿紅染，胞核圓形藍染。模型組出現(xiàn)明顯肝細胞損傷，細胞內(nèi)見大小不等的脂肪空泡，部分肝細胞胞漿淡染、疏松，肝索排列紊亂。給予芝麻素或維生素E后損傷明顯減輕(圖1)。Masson染色顯示，正常組肝臟血管周圍有少量纖維，呈藍紫色，模型組肝臟膠原纖維自中央靜脈區(qū)向匯管區(qū)延伸，在肝血竇大量沉積，治療組纖維增生明顯減少(圖2)，提示芝麻素及維生素E可明顯減輕三氯化鋁合并D-半乳糖誘發(fā)的肝損傷及膠原沉積。

表1 芝麻素對大鼠體質(zhì)量、肝臟濕質(zhì)量及肝臟質(zhì)量指數(shù)的影響Tab 1 Effects of sesamin on body weight,wet hepar weight and hepar index of

1.對照組,2.模型組,3.芝麻素組,4.芝麻素維生素E聯(lián)用組,5.維生素E組

1.對照組,2.模型組,3.芝麻素組,4.芝麻素維生素E聯(lián)用組,5.維生素E組

3.4 芝麻素對大鼠肝組織iNOS表達的影響 光鏡下可見正常對照組肝臟iNOS有少量表達，主要集中于匯管區(qū)，中央靜脈區(qū)較少，主要在肝細胞，胞漿顯棕色。模型組與對照組相比表達明顯增多，成塊狀甚至片狀分布。各給藥組陽性表達均明顯減少，見表2。

表2 芝麻素對大鼠肝組織iNOS表達的影響Tab 2 Effects of sesamin on iNOS expression in liver of rats with liver

3.5 芝麻素對大鼠肝臟NO水平的影響 與正常組相比，模型組NO水平顯著升高(P<0.01),各給藥組NO水平均明顯降低(P<0.05)，見圖3。

3.6 芝麻素對大鼠肝臟T-AOC、SOD及MDA水平的影響 與正常對照組相比，模型大鼠肝臟T-AOC及SOD水平明顯降低，MDA水平顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，芝麻素組與聯(lián)用組T-AOC、SOD水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，各治療組MDA水平均顯著降低(P<0.05)，見表3。提示芝麻素與維生素E均可有效提高機體抗氧化能力。

a P<0.05 vs.Control；b P<0.05 vs.model

4 討論

本實驗采用AlCl3及D-gal聯(lián)合造模12周，建立肝損傷模型，光鏡下可見肝細胞空泡，胞漿淡染，肝索排列紊亂，膠原纖維大量沉積，說明模型組大鼠肝臟出現(xiàn)損傷，模型建立成功。給予藥物治療后，肝細胞損傷情況明顯改善，膠原沉積減少，說明各治療藥物能夠改善AlCl3及D-gal引起的肝損傷。

T-AOC水平可綜合反映機體的抗氧化能力。SOD是自由基清除劑，可抑制自由基啟動的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。MDA是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，其含量可反映組織過氧化損傷程度。本研究顯示，造模12周后，模型組大鼠肝組織T-AOC、SOD水平顯著降低，MDA水平明顯升高，提示大鼠肝臟出現(xiàn)過氧化損傷。給予芝麻素或維生素E后，大鼠肝組織T-AOC和SOD活性明顯升高，MDA水平明顯降低，提示芝麻素與維生素E均可明顯提高大鼠肝組織抗氧化能力，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，這可能是減輕肝損傷、抑制肝組織膠原增生的主要機制之一。前期研究發(fā)現(xiàn)芝麻素與維生素E聯(lián)用時具有協(xié)同抗氧化作用[11]，本實驗發(fā)現(xiàn)芝麻素聯(lián)用維生素E組對SOD水平的改善優(yōu)于芝麻素組，但對肝細胞損傷及膠原沉積的改善無明顯優(yōu)勢，其原因有待于進一步研究。

表3 芝麻素對大鼠肝臟T-AOC、SOD及MDA水平的影響Tab 3 Effects of sesamin on T-AOC,SOD and the content of MDA in hepatic tissues of rat

綜上所述，芝麻素對AlCl3聯(lián)合D-半乳糖所致肝損傷具有明顯改善作用，其機制可能包括兩方面因素，一是提高肝臟的抗氧化能力，減少氧化損傷；其次是下調(diào)iNOS表達，從而防止大量持續(xù)的NO對肝臟的損傷。

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