錢衛(wèi)東， 寧肖肖， 王 蘭， 蔡長龍， 毛培宏， 李夢媛

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.西安工業(yè)大學(xué) 光電工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 3.新疆大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830046 )

0 引言

D-阿拉伯糖醇是一種五碳糖醇，分子式為C5H12O5，分子量為152.12，是木糖醇和核糖醇的同分異構(gòu)體.糖醇是經(jīng)糖還原的一類多元醇，具有低熱值、抗齲齒、不影響胰島素水平[1]等優(yōu)點，在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值.

目前，常規(guī)生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的方法主要是化學(xué)法合成[2].但是該方法反應(yīng)過程復(fù)雜、設(shè)備要求高、環(huán)境污染嚴(yán)重.針對化學(xué)合成法的缺點，人們將目光集中于通過生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，因其反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)工藝簡單而備受關(guān)注.

Spencer等[3]研究發(fā)現(xiàn)耐高滲酵母在高滲條件下可產(chǎn)生多元醇，代謝葡萄糖產(chǎn)生的多元醇主要有甘油、D-阿拉伯糖醇、赤醉糖醇等，其中五碳多元醇以D-阿拉伯糖醇為主[4].但是大部分產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的酵母菌株對底物葡萄糖的轉(zhuǎn)化率較低,并且普遍存在甘油及其它多元醇副產(chǎn)物.

乳酸克魯維酵母具有營養(yǎng)要求極其簡單、生物量大、生長溫度適應(yīng)范圍廣、分泌蛋白能力強(qiáng)、不產(chǎn)生內(nèi)毒素[5,6]、生長旺盛等優(yōu)點.因此,長期以來一直被用于發(fā)酵工業(yè).

低能離子N+注入技術(shù)作為一種新的誘變源，目前在國內(nèi)微生物育種方面已取得顯著成效[7,8].低能離子注入生物體時,同時存在能量交換、能量沉積、質(zhì)量沉積及電荷交換等四大效應(yīng).注入離子的電荷數(shù)、質(zhì)量數(shù)、能量和劑量的組合不同，可以提供較多的誘變條件，使離子注入誘變具有突變譜寬、突變率高等特點，從而可以篩選到符合生產(chǎn)要求、提高產(chǎn)量的突變體[9-11].然而,低能N+離子注入技術(shù)轉(zhuǎn)化的隨機(jī)性較大，因此建立一種高通量的快速高通量篩選方法尤為重要.

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

1.1.1 菌株

乳酸克魯維酵母(KluyveromyceslactisATCC12426),購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心.

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基(g/L): 葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨20，瓊脂20，121 ℃滅菌 20 min.

(2)種子培養(yǎng)基(g/L): 葡萄糖20， 酵母膏 10，蛋白胨 20，121 ℃滅菌 20 min.

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L): 葡萄糖200，酵母膏10，蛋白胨20，硫酸銨3，七水硫酸鎂0.2，121 ℃滅菌20 min.

1.2 低能N+離子注入

1.2.1 菌懸液的制備

將本實驗室保藏的出發(fā)菌株(KluyveromyceslactisATCC12426)于斜面培養(yǎng)基上劃線，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)18 h得到菌液.

1.2.2 菌膜制備

用無菌水將菌液稀釋至1.0×107CFU/mL，取100μL菌體稀釋液均勻涂布于無菌平皿中央，用無菌風(fēng)吹干制成菌膜.

1.2.3 離子注入

將菌膜置于離子注入機(jī)的無菌靶臺上，用能量為25 keV，不同劑量的離子束在10-3Pa真空狀態(tài)下以10 s脈沖方式，進(jìn)行離子注入.

1.2.4 重組菌株的預(yù)培養(yǎng)

經(jīng)過步驟1.2.3后，用2 mL YPD液體培養(yǎng)基浸泡菌膜，37 ℃溫育2 h，用無菌玻璃刮鏟洗脫平皿上的菌膜，獲得洗脫液；未注入的對照菌膜也作同樣處理.用移液槍將洗脫液轉(zhuǎn)移至裝有5 mL液體培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h.

1.3 高產(chǎn)菌株的初篩

D-阿拉伯糖醇高產(chǎn)菌株有耐高滲的特性，因此可以用高糖培養(yǎng)基進(jìn)行初篩.

1.3.1 高糖培養(yǎng)基組分的確定

按照1.2.1制備出發(fā)菌株的菌懸液，吸取100μL菌懸液均勻涂布于葡萄糖濃度分別為30%、40%、50%、60%的固體培養(yǎng)基上.將培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,觀察菌體的生長情況.

1.3.2 高糖培養(yǎng)基初篩

將1.2.4所得重組菌株的菌液涂布于高糖固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌體生長情況.

1.4 高產(chǎn)菌株的復(fù)篩

D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生菌株的復(fù)篩,采用紙色譜和高效液相色譜連用的方法.紙色譜具有設(shè)備簡單、操作方便、所需樣品少且靈敏度較高等優(yōu)點，其對于大量菌體的篩選實驗非常適合[12].

高效液相色譜[13]具有較高的準(zhǔn)確性、速度快、分辨率高、靈敏度高等優(yōu)點，適合對紙色譜法篩選結(jié)果進(jìn)行驗證實驗.高效液相色譜的色譜條件為色譜柱：SH1011；流動相：0.01 mol/LH2SO4；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：5μL；柱溫：50 ℃；檢測器：示差檢測器(RID).

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取D-阿拉伯糖醇、甘油、葡萄糖等各0.100 0 g，分別裝于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，配成單組分質(zhì)量濃度為1%的標(biāo)準(zhǔn)溶液.取2 mL的四種溶液混合均勻，即成混合標(biāo)樣.

1.4.2 樣品的處理

從高糖篩選培養(yǎng)基上挑取生長情況較好的單菌落接入種子培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h得種子液.將種子液按5%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于37 ℃，160 r/min 連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)120 h得發(fā)酵液.取80 mL發(fā)酵液于100 mL離心管中，12 000 r/ min離心5 min，將上清液80 ℃濃縮至10 mL得到樣品.

1.5 重組菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗

將1.4篩選出來的高產(chǎn)菌株以2%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min傳代培養(yǎng)8代，測定每代菌株發(fā)酵液中D-阿拉伯糖醇的產(chǎn)量.若每代菌株發(fā)酵液中D-阿拉伯糖醇的產(chǎn)量變化不大，則說明該菌株遺傳穩(wěn)定性高.

2 結(jié)果與討論

2.1 離子注入劑量的選擇

不同微生物細(xì)胞對誘變劑的敏感程度不同，只有在合適的劑量下才能獲得理想的誘變效果.本研究首先考察了不同注入劑量對乳酸克魯維酵母的影響.做出“馬鞍型”曲線，如圖1所示，存活率呈先下降再上升后下降的趨勢.

研究表明，當(dāng)以能量為25 keV、劑量低于2.0×1015ion/cm2離子注入Kluyveromyceslactis時，注入N+只對細(xì)胞表面造成損傷和刻蝕，存活率下降；隨著注入劑量的增加，細(xì)胞表面刻蝕嚴(yán)重，存活率急劇下降；當(dāng)注入劑量達(dá)到4.0×1015ion/cm2時，存活率下降到19%；隨著注入劑量繼續(xù)增加，可以激活細(xì)胞自身某種修復(fù)機(jī)制，存活率出現(xiàn)微幅回升；當(dāng)劑量繼續(xù)上升超過6.0×1015ion/cm2時，對細(xì)胞的破壞已經(jīng)嚴(yán)重超出了細(xì)胞本身的修復(fù)能力，細(xì)胞死亡，存活率急劇下降.所以，離子注入的最佳能量為25keV，劑量為6.0×1015ion/cm2.

圖1 氮離子注入乳酸克魯維酵母 的存活率曲線

2.2 高產(chǎn)菌株的初篩

2.2.1 高糖培養(yǎng)基組分的確定

觀察原始出發(fā)菌株在葡萄糖濃度分別為30%、40%、50%、60%的固體培養(yǎng)基上的生長情況如圖2所示.由圖2可知，隨著葡萄糖濃度的增加，原始出發(fā)菌株的生長情況變?nèi)?當(dāng)葡萄糖濃度為50%時，原始出發(fā)菌株已經(jīng)不能正常生長.因此，確定高糖篩選培養(yǎng)基葡萄糖濃度為50%.

圖2 高糖培養(yǎng)基菌體生長情況

2.2.2 高糖培養(yǎng)基初篩結(jié)果

將1.2.4所得重組菌株的菌液涂布于葡萄糖濃度為50%的高糖固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，挑取生長情況較好的菌落，用高糖培養(yǎng)基保藏菌種，以備復(fù)篩.

2.3 高產(chǎn)菌株復(fù)篩結(jié)果分析

2.3.1 紙色譜法展開體系的優(yōu)化

(1)展開劑的優(yōu)化

根據(jù)底物與產(chǎn)物均為羥基類物質(zhì)及物質(zhì)的相似相容性，對展開劑正丁醇：吡啶：水進(jìn)行不同配比組合的優(yōu)化，對混合標(biāo)品進(jìn)行層析，結(jié)果見表 1所示.

由表1中結(jié)果可知，隨著分子量的增大，遷移率逐漸減小，D-阿拉伯糖醇的遷移率較大，葡萄糖的遷移率較小.根據(jù) Rf值和分離度，選用了11號層析劑，即,正丁醇∶吡啶∶水=14∶3∶3.

表1 混合層析的Rf值

(2)點樣量的優(yōu)化

本研究對點樣量進(jìn)行考察，通過比較點樣量為0.5μL，1.0μL，1.5μL，2.0μL的情況,發(fā)現(xiàn)點樣量為1.5μL時分離效果較好;當(dāng)點樣量為2.0μL時，拖尾嚴(yán)重，很難將葡萄糖和D-阿拉伯糖醇分開;當(dāng)點樣量為0.5μL和1.0μL時，顯色斑點不清晰.

(3)顯色劑的優(yōu)化

常用的糖醇顯色劑主要是飽和硝酸銀丙酮溶液(A)-氫氧化鈉酒精溶液(B).顯色原理[14]是羥基與硝酸銀的硝酸根離子發(fā)生螯合作用將硝酸銀固定，噴上氫氧化鈉后，硝酸銀與氫氧化鈉會立即形成棕黑色的氧化銀，還原糖和糖醇在室溫下就能形成黑色顯色點.當(dāng)還原結(jié)束時，將濾紙浸泡在氨水中，溶解過量的氧化銀，然后用自來水沖洗，干燥后就能得到棕黑色的斑點.

本研究對A中的硝酸銀和B中的氫氧化鈉濃度進(jìn)行了優(yōu)化.發(fā)現(xiàn)將飽和硝酸銀和飽和氫氧化鈉優(yōu)化成50%時，顯色結(jié)果比沒有優(yōu)化前更加明顯，不需要用氨水退色也可以顯示出清晰的斑點，優(yōu)化結(jié)果見圖3所示.分析其原因，主要考慮兩點:其一,硝酸銀濃度應(yīng)該與目標(biāo)產(chǎn)物濃度相當(dāng);其二，硝酸銀濃度過大時，會使濾紙整體顯色太深，需要用氨水溶解多余的硝酸銀.

1：D-阿拉伯糖醇;2:D-阿拉伯糖醇和葡萄糖兩者的混合；3：葡萄糖圖3 展開體系優(yōu)化前后標(biāo)品的紙層析圖

2.3.2 紙色譜法復(fù)篩結(jié)果

將1.4得到的標(biāo)品和樣品按照2.3.1優(yōu)化后的展開體系進(jìn)行紙色譜分析，得到5株顯色斑點較大的菌株.

2.4 高效液相法復(fù)篩

將2.3.2得到的顯色斑點較大的5株菌株的發(fā)酵液濃縮后，用微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法對其進(jìn)行驗證.試驗結(jié)果表明，顯色較大的斑點所對應(yīng)的發(fā)酵液中D-阿拉伯糖醇含量較高，最高可達(dá)88.23 g/L.

2.5 重組菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果分析

將2.4篩選得到的高產(chǎn)菌株傳代培養(yǎng)8代，測定每代發(fā)酵液中D-阿拉伯糖醇的產(chǎn)量，其結(jié)果見圖4所示.D-阿拉伯糖醇的產(chǎn)量略有波動，但變化不顯著，說明該菌株遺傳穩(wěn)定性高.

圖4 高產(chǎn)菌株的傳代穩(wěn)定性試驗

3 結(jié)論

本研究利用低能N+離子注入技術(shù)對乳酸克魯維酵母進(jìn)行誘變，構(gòu)建了D-阿拉伯糖醇高產(chǎn)工程菌，通過做出馬鞍形曲線確定了離子注入的最佳劑量和能量組合.根據(jù)高產(chǎn)菌株具有耐高滲的性質(zhì)，建立了用高糖培養(yǎng)基進(jìn)行初篩的方法，再將紙色譜法與高效液相色譜法聯(lián)合使用進(jìn)行復(fù)篩.根據(jù)紙層析顯色斑點的大小篩選得到了較高產(chǎn)菌株，用高效液相色譜法對紙色譜法的篩選結(jié)果進(jìn)行了驗證.

試驗結(jié)果表明，本研究建立的高糖培養(yǎng)基初篩，以及紙色譜法與高效液相色譜法連用復(fù)篩的篩選方法專屬性強(qiáng)，操作方便，可以快速地從大批量誘變菌株中篩選出高產(chǎn)菌株.

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