王存德 張利娟 龔 泉 李雪芹 董 蕙

吲哚美辛對荷Lewis肺癌小鼠抗腫瘤作用的相關(guān)研究

王存德 張利娟 龔 泉 李雪芹 董 蕙

目的探索吲哚美辛對荷Lewis肺癌小鼠腫瘤生長的抑制作用。方法建立C57小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型并隨機分組，各組分別以吲哚美辛和生理鹽水連續(xù)灌胃16天，觀察各組小鼠的出瘤時間、用藥前后瘤體大小及變化，繪制瘤體生長曲線。結(jié)果吲哚美辛干預(yù)組的腫瘤體積小于生理鹽水對照組（P＜0.05），腫瘤抑制率高于生理鹽水對照組（P＜0.05）。結(jié)論吲哚美辛對荷Lewis肺癌小鼠腫瘤生長具有顯著的抑制作用。

吲哚美辛；Lewis肺癌；小鼠

惡性腫瘤嚴重威脅著人類健康與生命，伴隨著人們對惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程認識的逐步深入，在惡性腫瘤的治療中靶向治療發(fā)揮著越來越重要的作用，其中成為研究者們最為關(guān)注的焦點是以腫瘤血管為靶點的治療策略[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，吲哚美辛具有抑制促血管生因子（如VEGF）表達的作用，從而阻斷腫瘤血管的生成，抑制腫瘤的生長[2]。本研究應(yīng)用吲哚美辛作用于荷瘤小鼠，初步探索吲哚美辛抗腫瘤生長的作用。

1 資料與方法

1.1 試劑與藥品 吲哚美辛、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基粉劑及胎牛血清均購于Gibco公司。

1.2 實驗動物及細胞 Lewis小鼠肺癌細胞株購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），SPF級C57小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)與接種 首先將 Lewis細胞株用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，當細胞貼壁長滿單層后用0.25%胰蛋白酶消化，將培養(yǎng)液吹打混勻，1000rpm×5min離心，收集細胞用無菌 PBS稀釋，在顯微鏡下計數(shù)后將濃度調(diào)整至1×106～7/ml，取0.2ml細胞懸液接種于C57小鼠右側(cè)腋后線皮下，觀察腫瘤的生長，待體積達1000mm3左右時移植至小鼠右側(cè)腋窩附近皮下。

2.2 造模與分組 選擇生長良好、瘤體無破潰的荷瘤小鼠，斷頸法處死，在超凈工作臺內(nèi)完整剝離瘤體，用無菌生理鹽水清洗血漬，清除中心壞死組織，充分勻漿以制備瘤細胞懸液，加生理鹽水調(diào)整細胞懸液濃度至1×106～7/ml。每只小鼠取0.2ml懸液接種于右側(cè)腋后線皮下，構(gòu)建荷瘤小鼠22只（接種操作在 30min內(nèi)完成）。10d后腫瘤體積達到 100～200mm3時，將建立好的小鼠模型隨機分為吲哚美辛干預(yù)組和生理鹽水對照組，吲哚美辛干預(yù)組 16只小鼠，每天以吲哚美辛灌胃；生理鹽水對照組 6只，每天以生理鹽水灌胃。其中，吲哚美辛干預(yù)組又分為高劑量組和低劑量組，低劑量組每天以吲哚美辛2mg/kg灌胃，高劑量組每天以吲哚美辛4mg/kg灌胃。觀察各組小鼠的出瘤時間、給藥前后瘤體的大小及變化，同時觀察給藥前后各組小鼠的整體狀況，如飲食量、體重、皮膚色澤、反應(yīng)靈敏度及活動能力等。

2.3 給藥劑量與方法 分組當天開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)16天（給藥劑量采用人與動物劑量換算法確定）。吲哚美辛干預(yù)組：吲哚美辛分別按2mg/kg/d和4mg/kg/d灌胃給藥；生理鹽水對照組：生理鹽水每天0.2ml/10g灌胃。

2.4 計算方法 每四天測量一次，具體方法為用藥前后用毫米游標卡尺測量腫瘤長、寬最大垂直直徑，并按如下公式計算腫瘤體積：腫瘤體積（mm3）=（腫瘤長徑×腫瘤短徑2）/2，同時繪制各組小鼠腫瘤生長曲線。用藥結(jié)束后兩天斷頸法處死小鼠，分離瘤體并稱重，通過下列公式計算兩組腫瘤抑制率：腫瘤抑制率%=（1―吲哚美辛干預(yù)組平均瘤重/生理鹽水對照組平均瘤重）×100%。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察 造模前各組小鼠一般狀況良好，生理鹽水對照組與吲哚美辛干預(yù)組小鼠平均體重分別為（17.67±1.48）g、（17.72±0.89）g，兩組初始體重無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），具有可比性。實驗過程中動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)生理鹽水對照組小鼠進食、飲水情況基本正常，但反應(yīng)較為遲鈍，活動狀況較植瘤前明顯減少；吲哚美辛干預(yù)組小鼠反應(yīng)較生理鹽水對照組靈敏，飲水、進食及活動等狀況良好。實驗完成時22只小鼠均存活，但吲哚美辛組小鼠有糞便中帶血及輕度腹瀉的情況。

3.2 各組腫瘤體積動態(tài)變化 吲哚美辛干預(yù)組﹑生理鹽水對照組C57小鼠Lewis肺癌移植瘤的體積變化情況見表1和圖1。從表1和圖1可以看出，自用藥后第4天起，生理鹽水對照組腫瘤體積大于吲哚美辛干預(yù)組，且統(tǒng)計結(jié)果表明差異有顯著性（P＜0.05）；從表2及圖2可以看出，吲哚美辛低劑量組與高劑量組腫瘤體積比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表1 吲哚美辛干預(yù)組、生理鹽水對照組對C57小鼠Lewis肺癌移植腫瘤體積變化比較(±s)

表1 吲哚美辛干預(yù)組、生理鹽水對照組對C57小鼠Lewis肺癌移植腫瘤體積變化比較(±s)

注：與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05

組別 n d0 d4 d8 d12 d16腫瘤體積(mm3)生理鹽水對照組 6 84.92±15.39 162.04±39.38 351.12±39.68 944.62±79.84 1638.43±256.63吲哚美辛干預(yù)組 16 83.82±14.26 121.24±14.12* 207.93±15.92* 685.07±69.39* 1258.48±133.41*P 0.877 0.048 0.032 0.015 0.013

表2 吲哚美辛低劑量組與吲哚美辛高劑量組腫瘤體積的動態(tài)變化比較(±s)

表2 吲哚美辛低劑量組與吲哚美辛高劑量組腫瘤體積的動態(tài)變化比較(±s)

注：吲哚美辛低劑量組與高劑量比較，P＞0.05

組別 n d0 d4 d8 d12 d16腫瘤體積(mm3)吲哚美辛低劑量組 8 83.07±16.19 120.90±15.76 211.14±16.97 678.05±76.01 1262.47±168.08吲哚美辛高劑量組 8 84.57±13.13 121.57±13.37 204.72±15.20 692.09±66.54 1254.47±99.26 P 0.841 0.928 0.439 0.700 0.909

圖1 吲哚美辛干預(yù)組與生理鹽水對照組腫瘤生長曲線

圖2 吲哚美辛低劑量組與吲哚美辛高劑量組腫瘤生長曲線

3.3 腫瘤抑制率 吲哚美辛干預(yù)組與生理鹽水對照組對C57小鼠Lewis肺癌移植瘤生長抑制作用，結(jié)果見圖3及表3。結(jié)果表明，吲哚美辛干預(yù)組腫瘤瘤重較生理鹽水對照組輕，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。吲哚美辛干預(yù)組的腫瘤平均抑制率為12.6%，其中吲哚美辛低劑量組、吲哚美辛高劑量組的腫瘤平均抑制率分別為 13.3%、11.9%。吲哚美辛高劑量組的腫瘤平均抑制率和腫瘤重量與低劑量組相比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖3 吲哚美辛干預(yù)組與生理鹽水對照組移植瘤重量比較

表3 吲哚美辛低劑量組與生理鹽水對照組腫瘤重量(±s)與抑瘤率(%)比較

表3 吲哚美辛低劑量組與生理鹽水對照組腫瘤重量(±s)與抑瘤率(%)比較

注：與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05

組別 n 腫瘤重量(g) 腫瘤抑制率生理鹽水對照組 6 1.42±0.18 -吲哚美辛干預(yù)組 16 0.82±0.14* 12.6 P 0.001 -

4 討論

在專家、學者多年的不斷努力之下，惡性腫瘤的治療已經(jīng)取得了若大的進步，并有了一定的療效，但對惡性腫瘤的整體治愈率依然存在一定的差異[3]。目前對于加強惡性腫瘤的臨床和基礎(chǔ)研究，最現(xiàn)實的意義就是尋找有效的治療方法和經(jīng)濟實用的治療藥物[4]。研究發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與慢性炎癥有著緊密的聯(lián)系。炎癥反應(yīng)就像一把雙刃劍，除了可以引起抗腫瘤反應(yīng)之外，更多的是促進了腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管的生成。研究表明，腫瘤細胞的增殖、壞死和凋亡可刺激局部微環(huán)境內(nèi)的巨噬細胞釋放炎癥介質(zhì)，進而刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生趨化因子、細胞因子、黏附分子及生長因子等，吸引更多的巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、肥大細胞和中性粒細胞的聚集，其將釋放各種生長因子、基質(zhì)金屬蛋白水解酶和趨化因子等以促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移，并水解組織間質(zhì)成分，從而促進組織重建、血管生成、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，研究者稱之為炎癥依賴性或炎癥性血管生成[5-6]。炎性血管生成的理論為抗腫瘤生成提供了新的策略，使用天然或合成的抗炎藥物來抑制腫瘤血管新生，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移成為了一個可行的途徑。

吲哚美辛（IN）又稱消炎痛，是NSAIDs中常見的一種藥物。本研究初步探索了吲哚美辛對荷Lewis肺癌小鼠腫瘤抑制的作用。本研究表明，應(yīng)用吲哚美辛后，吲哚美辛干預(yù)組與生理鹽水對照組相比，腫瘤體積均有不同程度的縮小，且差異具有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；然而，吲哚美辛低劑量組與高劑量組相比，小鼠腫瘤體積無明顯差異（P＞0.05）。對腫瘤抑制率的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，吲哚美辛干預(yù)組的腫瘤抑制率與生理鹽水對照組比較有顯著的統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而吲哚美辛低劑量組與高劑量組相比，腫瘤抑制率無明顯差異（P＞0.05）。上述結(jié)果表明，應(yīng)用吲哚美辛對小鼠Lewis肺癌腫瘤生長有明顯的抑制作用，而吲哚美辛低劑量組與高劑量組其腫瘤抑制作用無明顯的差異。研究認為，本文所涉及的吲哚美辛用藥劑量是由人類用藥劑量換算而來的，吲哚美辛對腫瘤的抑制作用是否存在劑量依賴性，以及其抑制腫瘤的最佳劑量仍需進一步研究探索。

本研究從生活中極為常見的非甾體類抗炎藥物吲哚美辛出發(fā)，以荷Lewis肺癌小鼠為研究對象，初步證實了吲哚美辛具有顯著的抗腫瘤作用。本研究結(jié)果為日后進一步研究聯(lián)合抗炎藥物抗腫瘤機制，特別是對研究抗腫瘤血管生成等方面提供了大量的參考信息。

[1] Ferrara N,Kerbel RS.Angiogenesis as a therapeutic target[J]. Nature,2005,438(7070):967-974.

[2] Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications[J].N Engl J Med,1971,285(21):1182-1186.

[3] Mahmud SM,Franco EL,Aprikian AG,et al.Use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and prostate cancer risk:a meta-analysis[J]. Int J Cancer,2010,127(7):1680-1691.

[4] Lanas A.Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and cyclooxygenase inhibition in the gastrointestinal tract:a trip from peptic ulcer to colon cancer[J].Am J Med Sci,2009,338(2):96-106.

[5] Scapini P,Morini M,Tecchio C,et al.CXCL1/macrophage inflammatory protein-2-induced angiogenesis in vivo is mediated by neutrophil-derived vascular endothelial growth factor-A[J].J Immunol, 2004,172(8):5034-5040.

[6] Benelli R,Morini M,Carrozzino F,et al.Neutrophils as a key cellular target for angiostatin:implications for regulation of angiogenesis and inflammation[J].FASEB J,2002,16(2):267-269.

The related study on Antitumor effect of Indomethacin on mice Bearing Lewis lung Cancer

Wang Cunde Zhang Lijuan Gong Quan Li Xueqin Dong Hui

ObjectiveTo prove the effects of indomethacin on inhibiting tumor growth of rats' Lewis pulmonary tumor(LLC).MethodsLLC transplant model was built to set up control group and indomethacin group.Each group were lavaged with indomethacin and saline for 16 days.To observe the tumor growth time,tumor size,and changes before and after treatment,and draw the tumor growth curve.ResultsThe tumor volume of Indomethacin group less than the saline control group(P＜0.05),and the tumor control rate is higher than the saline control group(P＜0.05).ConclusionsIndomethacin have the significant inhibition effect on the tumor growth of transplanted rats' Lewis pulmonary tumor.

Indomethacin;Lewis pulmonary tumor;Rat

R734.2

A

1673-5846(2014)02-0037-04

云南省腫瘤醫(yī)院昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院姑息醫(yī)學科，云南昆明 650118