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新技術交流

PCR-HRM分析篩查成骨不全一家系患兒基因突變

白雪1李克秋2任秀智3何曉波2王毅1官士珍1景亞青2李光2△

目的采用PCR-高分辨率熔解曲線（HRM）分析篩查成骨不全（OI）一家系患兒（先證者）COL1A1基因突變位點，探討其基因型與臨床表型的聯系。方法對先證者進行家族史及臨床資料的調查，采集先證者、家屬及50名正常對照者血液標本，應用PCR-HRM分析篩查先證者及正常對照者COL1A1基因突變，基因測序確證突變位點。結果先證者COL1A1基因17外顯子篩查結果異常，其熔解溫度（Tm）值比正常對照者Tm值低約0.4℃。先證者與正常對照者的標準熔解曲線及差異熔解曲線均有明顯差異。測序結果為c.1138G＞A，突變導致380位氨基酸由甘氨酸（Gly）變成絲氨酸（Ser）：p.（Gly 380 Ser），為錯義突變。先證者父親、祖母均具有相同突變位點。先證者母親及正常對照者基因測序結果無此突變。該突變在中國人群中未見報道。該家系遺傳特征為常染色體顯性遺傳，先證者臨床診斷為Ⅳ型OI，臨床表型較嚴重。結論PCR-HRM分析是有效的OI基因篩查新方法。COL1A1基因c.1138G＞A突變在中國人群中為新發(fā)現的突變位點。α螺旋結構域Gly被替換可能導致較嚴重的臨床表型。

成骨不全；遺傳篩查；聚合酶鏈反應；點突變；系譜；COL1A1基因；高分辨率熔解曲線分析

成骨不全（osteogenesis imperfecta，OI）又稱脆骨病，是一種遺傳異質性結締組織病，與Ⅰ型膠原缺陷相關，患者因骨量減少、骨強度減弱，導致骨脆性增加，表現為易骨折、骨骼畸形及生長缺陷。OI骨骼外表現包括：藍色鞏膜、牙質形成不全和青春期后不同程度的聽力損失等[1]。OI發(fā)病率約為1/10 000[2]，90％以上OI患者由編碼Ⅰ型膠原α1/α2鏈的基因COL1A1/COL1A2突變引起[3]。OI的臨床表現輕重不等，從無明顯臨床癥狀到致死型均可發(fā)生[1]?；驒z測可為OI確診、產前診斷及遺傳咨詢提供依據，但COL1A1/COL1A2基因突變缺乏突變熱點，基因篩查工作量大、成本高。近年來，高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）分析在醫(yī)學領域中發(fā)展迅速，已在多種疾病的基因突變檢測中證實其有效性[4-5]。本研究采用PCR-HRM分析篩查OI家系患兒（先證者）COL1A1基因突變位點，探討其在OI基因研究中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集1例2011年12月9日在我院住院的OI患兒（先證者）及其家系的臨床資料，包括家族史、骨折情況、骨骼畸形、非骨骼異常及X線檢查情況等。繪制家系圖譜，分析遺傳特征。OI家屬簽署“知情同意書”。先證者男，9歲，漢族。臨床診斷為Ⅳ型OI，其父母否認近親婚配。先證者身高120 cm，體質量23 kg，藍色鞏膜，牙質形成不全，雞胸?；純撼錾?8 d，即發(fā)生不明原因的上肢骨折，之后發(fā)生約30次四肢骨折，逐漸出現雙下肢向前向外彎曲畸形，自3歲后不能行走，雙下肢肌肉萎縮。X線片示：胸部畸形、左肱骨遠段畸形、雙脛腓骨干可見彎曲畸形、雙股骨干畸形、關節(jié)畸形、骨干纖細、骨皮質菲薄、骨質密度低，胸部、上肢、雙下肢骨質疏松，見圖1。家系調查顯示，先證者父親、祖母及家系中其他3位親屬均患有OI，見圖2。家系患者的臨床表型，見表1。

Fig.1 X-rays of the proband圖1 先證者X線片

Tab.1 Clinical phenotype of OI family表1 OI家系患者的臨床表型

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA制備采集先證者及家屬（先證者父親、母親、祖母）及50名正常對照者的靜脈血，EDTA抗凝。采用美國AxyPrep血基因組試劑盒，提取DNA標本，使用Nano-Drop 2000核酸定量分析儀（德國）檢測DNA濃度及純度，DNA標本放置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計及合成PCR-HRM引物設計參照Gentile 等[6]文獻報道，引物設計覆蓋了COL1A1基因的編碼區(qū)和相鄰的外顯子-內含子交界處。擴增產物大小平均149 bp，對較長或有復雜熔解域的外顯子，選擇兩對或多對引物。引物由上海生工合成。

Fig.2 Pedigree chart圖2 家系圖

1.2.3PCR-HRM分析篩查COL1A1基因突變采用QIAGEN公司（德國）Type-it HRM PCR Kit試劑盒，飽和染料為EvaGreen。采用基因公司（美國）illumina Eco熒光定量PCR儀，反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性10 s、退火溫度（58～64℃）30s、72℃延伸10s，40個循環(huán)。每份樣本總反應體積為10 μL，PCRMasterMix 5μL，上、下游引物各10μmol/L0.7 μL；模板DNA及無酶水體積之和為3.6 μL，反應體系模板DNA均為30 ng。HRM分析條件為95℃預處理15s，熔解溫度為65～95℃，溫度上升速率0.1℃/s，每升高1℃采集10次熒光信號數據，Eco V3.0軟件對熔解曲線進行分析，每個樣本重復2次。

1.2.4 長片段引物的擴增及測序針對PCR-HRM分析異常的基因區(qū)域自行設計長片段引物，PCR-HRM分析先證者COL1A1基因17外顯子區(qū)域結果異常，設計長片段引物，上游：5′-CAGCCCGTTCACTAACACCT-3′；下游：5′-ATTGGCACCTTTAGCACCAG-3′。采用Applied Biosystems公司梯度PCR儀（美國），測序由上海生工完成。

1.2.5 序列分析應用BLAST及GENETOOL等生物信息學軟件分析測序結果，與GenBank上的參考序列進行對比分析，確定突變位點及編碼氨基酸序列的變化。在人類膠原突變數據庫（https://www.le.ac.uk/genetics/collagen/）中確定是否為新發(fā)現的突變位點。

2 結果

2.1PCR-HRM分析篩查COL1A1基因突變PCRHRM分析篩查顯示，先證者COL1A1基因17外顯子區(qū)域結果異常，先證者該區(qū)域擴增片段的熔解溫度（Tm）值為88.6℃，正常對照平均Tm值為（89.0± 0.05）℃，兩者Tm值相差約0.4℃。標準熔解曲線提示，先證者COL1A1基因17外顯子區(qū)域存在雜合突變，見圖3。

Fig.3 High resolution melting curve’s圖3 HRM熔解曲線

2.2 測序結果COL1A1基因17外顯子長片段引物的擴增產物為391 bp，先證者測序結果為：位于COL1A1基因17外顯子c.1138G＞A雜合突變，也就是cDNA 1138位堿基G突變成A，先證者父親及祖母測序結果與先證者相同。先證者母親及正常對照測序結果與GenBank上參考序列相同，見圖4。

Fig.4 Sequencing curves of probands and their families圖4 先證者及家屬測序圖

3 討論

OI主要由COL1A1/COL1A2基因突變引起，該基因突變散布在整個基因，無突變熱點。目前已發(fā)現1 100多種COL1A1/COL1A2基因突變。突變形式有單個堿基置換、插入、缺失、重復、移碼和剪接位點等。通常每個家系有自己的“私有突變”[7]。Sanger測序被認為是OI基因診斷的金標準[8]，但測序所需工作量大、費用高。2012年，Gentile等[6]首次采用定量PCR-HRM分析篩查OI患者COL1A1/COL1A2基因突變，表明該方法具有快速、成本低及靈敏度高等優(yōu)點，適于OI基因測序前的突變篩查。HRM分析是新興的基因篩查和分型的遺傳學分析方法[9]，該方法基于有序列變化的擴增產物間微小的Tm值差異及NA片段熔解曲線的差異，進行基因突變篩查，能夠區(qū)分單個堿基的變化[10]。本研究采用PCR-HRM方法篩查OI患兒COL1A1基因突變，優(yōu)化了PCRHRM分析條件，篩查出先證者COL1A1基因17外顯子Tm值較正常對照低約0.4℃。先證者標準熔解曲線的形狀與正常對照明顯不同，提示雜合突變。測序結果證實，cDNA的1138位堿基為G/A的雜合突變。先證者父親及祖母均具有相同的突變位點，先證者母親及正常對照該測序結果與GenBank上參考序列相同。結合該家系遺傳特征，先證者基因突變（c.1138G＞A）來自其父親及祖母的遺傳。

目前，國內對于OI的診斷主要根據臨床特征和影像學改變[11]，仍以Sillence分型為主。Sillence等[12]根據患者臨床特征和組織病理學特性將OI分為Ⅰ～Ⅳ型，由COL1A1/COL1A2基因突變引起。Ⅰ型病情最輕，多無骨骼畸形，患兒身高正?；蚪咏＃虎蛐妥顕乐?，在母體子宮內即發(fā)生骨折，常在圍產期死亡；Ⅲ型屬于非致死型中最嚴重的亞型，四肢進行性畸形，大多患兒身材十分矮小，牙質形成不全，脊椎壓縮和側彎。Ⅳ型病情屬于中度，臨床表現多與Ⅰ型和Ⅲ型相同，多數患者可下床行走，鞏膜著色，牙質形成不全，聽力受損和身材矮小的發(fā)生率變異較大[1]。骨折次數、骨骼畸形程度及牙質形成不全通常與疾病的嚴重程度相關[3]。身材矮小或增長不足是嚴重OI的又一關鍵特征[7]。本研究先證者及家系患者身高明顯低于正常人，骨折次數7～30次，均有藍色鞏膜、牙質形成不全、下肢畸形，影響行走功能。先證者臨床診斷為Ⅳ型OI，家系中OI患者的整體臨床表型較為嚴重。

Ⅰ型膠原蛋白是骨骼、肌腱、韌帶和皮膚中的主要細胞外基質蛋白。由2條α1鏈和1條α2鏈組成3股螺旋結構，分別由COL1A1和COL1A2基因編碼。每條鏈的螺旋區(qū)域含有338個連續(xù)重復的Gly（甘氨酸）-X-Y基本結構，Gly在該結構中不可缺少，Gly側鏈殘基能調節(jié)膠原內部3股螺旋的空間結構，對于螺旋正確的折疊至關重要。本研究先證者COL1A1基因17外顯子1138位的堿基G突變成A，使380位的Gly替換為Ser，該Gly位于α1鏈螺旋區(qū)域中。已有研究表明，Ⅰ型膠原α1和α2鏈三股螺旋結構域中最常見的突變形式為Gly被Ser替代，使Ⅰ型膠原結構異常，通常表現為臨床表型較為嚴重的Ⅱ～Ⅳ型[8，13-14]。另外，在分析基因型與臨床表型的聯系時，還應考慮環(huán)境因素及個體差異可能對表型的影響。目前，對于OI基因型和臨床表型間的具體關系還不清楚[13]，相關研究及探討，將為其提供理論基礎。

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（2014-01-07收稿2014-02-21修回）

（本文編輯魏杰）

PCR-HRM Analysis for Gene Mutation Screening in a Child with Osteogenesis Imperfecta

BAI Xue1,LI Keqiu2,REN Xiuzhi3,HE Xiaobo2,WANG Yi1,GUAN Shizhen1,JING Yaqing2,LI Guang2
1 Department of Medical Laboratory，Tianjin Hospital，Tianjin 300211，China；2 Department of Biology,Tianjin Medical University；3 Department of Orthopedics Ward,Tianjin Wu Qing People′s Hospital
LI Guang，E-mail：lig@tijmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate COL1A1 gene mutation by PCR-high resolution melting(PCR-HRM)and analyze the correlation between genotype and clinical phenotype in a child(proband)with osteogenesis imperfecta(OI).MethodsThe family history of OI pedigree along with the clinical data was collected.Blood samples from the proband and his family members,as well as 50 normal controls,were collected.The mutation of COL1A1 gene was screened using PCRHRM and validated by the gene sequence.ResultsThe detection of PCR-HRM showed the abnormal result of COL1A1 17 exon in proband with a lower melting temperature(Tm)value than that of normal controls by 0.4℃.There were significant differences in the standardization melting curve and the different melting curve between the proband and the normal controls.The sequencing result was c.1138G＞A,which meant that cDNA of 1138 base G mutation into A.The mutations transformed the amino acid glycine into a serine at amino acid 380（P.Gly 380 Ser),which resulted in missense mutations.The proband’s father and grandmother had the same mutation of COL1A1 gene.The mutation was not found in the proband’s mother and normal controls.There was no report for such mutation in Chinese population.Pedigree analysis showed the family genetic characteristics of autosomal dominant inheritance.The proband was clinically diagnosed as OI typeⅣwith more severe clinical phenotype.ConclusionPCR-HRM analysis is a new effective method for genetic screening of OI.COL1A1 mutation of c.1138G＞A is a newly discovered mutation in Chinese population.Gly replaced in α helical domain may lead to a more severe clinical phenotype.

osteogenesis imperfecta;genetic screening;polymerase chain reaction;point mutation;pedigree; COL1A1 gene;high-resolution melting

R394.112，R681.31

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.020

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）資助項目（2012AA021003）；國家自然科學基金資助項目（21177091）；天津市衛(wèi)生局科技基金資助項目（2013KZ072）

1天津市天津醫(yī)院檢驗科（郵編300211）；2天津醫(yī)科大學生物學教研室；3天津市武清區(qū)人民醫(yī)院骨科三病區(qū)

△通訊作者E-mail：lig@tijmu.edu.cn