劉露,公春艷,趙宏濤,王鵬,李園園

一株泡葉藻降解菌的篩選及其發(fā)酵條件優(yōu)化

劉露,公春艷,趙宏濤,王鵬,李園園*

青島明月藍(lán)海生物科技有限公司,山東青島266400

為了利用微生物降解泡葉藻，本研究以泡葉藻為唯一營養(yǎng)物質(zhì)從土壤中篩選到一株對(duì)泡葉藻有明顯降解效果的菌株，編號(hào)2-2。根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析鑒定該菌株為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。對(duì)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為：泡葉藻30 g/L、酵母粉6 g/L和葡萄糖4 g/L。搖瓶最佳培養(yǎng)條件為：250 mL三角瓶裝液量50 mL，起始pH 7.5，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵48 h有效活菌數(shù)為2.4×109CFU/mL。并對(duì)發(fā)酵液酶活進(jìn)行了測(cè)定，其中纖維素酶活為47.7 U/mL，蛋白酶活為3.4 U/mL，海藻膠裂解酶活為0.721 U/mL。研究結(jié)果表明巨大芽孢桿菌2-2同時(shí)具有海藻膠裂解酶、蛋白酶和纖維素酶活性，具有良好的應(yīng)用前景。

泡葉藻降解菌;巨大芽孢桿菌;海藻膠裂解酶;發(fā)酵條件

我國海洋資源豐富，海藻加工及其高值化利用成為我國海洋資源綜合利用的重要領(lǐng)域。海藻生長在海洋的環(huán)境中，造就了海藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及其化學(xué)組成不同于陸地植物。海藻富含糖、蛋白質(zhì)、脂肪、無機(jī)鹽、各種維生素和微量元素[1]。海藻具有促進(jìn)早期種子萌發(fā)與成苗、改善作物形態(tài)與產(chǎn)量、提高作物的抗性和延長采收后易腐產(chǎn)品貯存期的作用。海藻除了具有促進(jìn)作物生長的特性外，還會(huì)影響土壤物理、化學(xué)和生物特性，進(jìn)而影響作物的生長[2]。泡葉藻是泡葉藻屬的一種海藻，是比較好的生產(chǎn)海藻肥的原料。

泡葉藻降解的方法有化學(xué)法、物理法和生物發(fā)酵法。目前最常用的方法是化學(xué)提取法，但采用化學(xué)提取法最大的劣勢(shì)在于強(qiáng)堿高溫會(huì)破壞海藻內(nèi)源物質(zhì)的活性。生物發(fā)酵法是利用微生物在以海藻等為養(yǎng)分的代謝過程中產(chǎn)生的多種酶，將構(gòu)成海藻的大分子物質(zhì)降解成小分子、水溶性的物質(zhì)，最大限度完整地保留了海藻中的生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)。以生物降解取代傳統(tǒng)的化學(xué)降解已成趨勢(shì)，因此海藻的微生物降解有著深遠(yuǎn)的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

自1968年Kaiser[3]等首次報(bào)道分離自梭菌Clostridium alginolyticum的胞外褐藻膠裂解酶以來，對(duì)褐藻膠裂解酶的研究取得了長足的發(fā)展。目前，關(guān)于生物法海藻降解的研究一般是集中于海藻膠分解菌的篩選、鑒定和海藻膠裂解酶的克隆與表達(dá)。能夠降解海藻膠的菌株有很多，主要有黃桿菌（Flavobacterium multivolum）[4]、弧菌(Vibrio sp.)[5]、白蟻菌屬(Isoptericola)[6]、假單胞菌(Pseudomonalginovora)[7]和芽孢桿菌(Bacillus circulans)[8]等。泡葉藻內(nèi)除含有海藻膠外，還有糖、蛋白質(zhì)、脂肪、無機(jī)鹽等組分，然而對(duì)泡葉藻的生物降解的研究卻很少。

本研究篩選出一株降解泡葉藻的細(xì)菌，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)研究發(fā)酵液中纖維素酶、蛋白酶和海藻膠裂解酶的酶活。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 樣品來源土樣：采自青島膠南蔬菜大棚。

1.1.2 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基與初篩培養(yǎng)基：泡葉藻10 g，瓊脂15 g，水1 L，pH 7.0；復(fù)篩培養(yǎng)基：泡葉藻10 g，水1 L，pH 7.0；種子培養(yǎng)基：泡葉藻5 g，酵母粉5 g，葡萄糖5 g，水1 L，pH 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：泡葉藻10 g，水1 L，pH 7.0。

1.2泡葉藻降解菌株的篩選

將連續(xù)富集3代的培養(yǎng)液用無菌水按照10-3到10-5進(jìn)行梯度稀釋，吸取0.1 mL的稀釋液涂布到初篩培養(yǎng)基平板上。32℃恒溫培養(yǎng)72 h后，觀察菌落形態(tài)，選取生長良好的菌株進(jìn)行劃線純化。

1.3菌株2-2的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)特征與生理生化特征鑒定將菌株2-2涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，32℃培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞形態(tài)和菌落特征，部分生理生化鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]。

1.3.2 16S rDNA鑒定基因組總DNA提取后，利用正向引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和反向引物ACGGCTACCTTGTTACGACT進(jìn)行16S rDNA全序列擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增效果。將克隆后的樣品送至華大基因進(jìn)行測(cè)序。

將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行Blast分析比對(duì)，并選取相似性較高的菌株，利用Mega 4.0軟件采取Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4酶活力的測(cè)定

1.4.1 纖維素酶活的測(cè)定采用DNS法測(cè)定纖維素酶活，發(fā)酵液3000 r/min離心10 min，離心后的上清液即為粗酶液。取3支大試管，1支作為空白對(duì)照，其余2支作為平行樣品管。樣品管中加1.0 mL原樣酶液，然后3支試管中分別加入4.0 mL已預(yù)熱至60℃的CMC緩沖液，在60℃水浴鍋中反應(yīng)20 min取出，每管立即加入3.0 mL DNS顯色液，搖勻后在對(duì)照管中再加入1.0 mL原樣酶液。將3支試管放入沸水浴中，顯色5 min后立即取出，流水冷卻，用分光光度計(jì)于490 nm處測(cè)其OD值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出產(chǎn)生的葡萄糖量。

酶活力單位：1 mL原樣酶液，1 min產(chǎn)生1 μg葡萄糖定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

U=k×(m1-m0)/20，其中k表示樣品稀釋倍數(shù)；m1表示樣品葡萄糖量，單位μg；m0表示對(duì)照葡萄糖量，單位μg；20表示酶與底物反應(yīng)時(shí)間，單位min。

1.4.2 蛋白酶活的測(cè)定酶活力單位：1 g固體酶粉（或1 mL液體酶），在一定溫度和pH條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位。

L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及酶活測(cè)定方法參照QB/T 1803-1993[10]。

1.4.3 海藻膠裂解酶活的測(cè)定酶活測(cè)定方法參照Preiss方法[11]。取0.9 mL 3g/L海藻酸鈉（3 g海藻酸鈉溶于1L 100 mmol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液），加入0.1 mL酶液，40℃保溫15 min，以滅活酶液（100℃5 min）作空白，測(cè)定反應(yīng)體系在235 nm的光吸收值。酶活力單位（U）定義為：在以上條件下，使每分鐘光吸收值增加0.1的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.5發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 碳源對(duì)菌株發(fā)酵的影響發(fā)酵培養(yǎng)基中添加10 g/L泡葉藻，另外分別添加5 g/L葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉和玉米淀粉，初始初始pH 7.0，32℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，48 h后測(cè)定發(fā)酵液中的活菌數(shù)量以確定最佳碳源。

1.5.2 氮源對(duì)菌株發(fā)酵的影響發(fā)酵培養(yǎng)基中添加10 g/L泡葉藻，5 g/L葡萄糖，另外分別添加5 g/L酵母粉、牛肉膏、硫酸銨、蛋白胨和尿素，初始初始pH 7.0，32℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，48 h后測(cè)定發(fā)酵液中的活菌數(shù)量以確定最佳氮源。

1.5.3 泡葉藻添加量對(duì)菌株發(fā)酵的影響泡葉藻含量分別為0 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L和50 g/L，另外加入5 g/L葡萄糖和5 g/L酵母粉，初始初始pH 7.0，溫度32℃，裝液量為250 mL三角瓶裝50 mL培養(yǎng)基，發(fā)酵時(shí)間48 h。

1.5.4 初始pH對(duì)菌株2-2的影響分別選擇初始pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，其他發(fā)酵條件為：溫度32℃，裝液量為250 mL三角瓶裝50 mL培養(yǎng)基，發(fā)酵時(shí)間48 h。

1.5.5 發(fā)酵溫度對(duì)菌株2-2的影響發(fā)酵溫度選擇27℃、29℃、31℃、32℃、33℃、35℃和37℃，初始pH 7.0.裝液量為250 mL三角瓶裝50 mL培養(yǎng)基，發(fā)酵時(shí)間48 h。

1.5.6 裝液量對(duì)菌株2-2的影響在250 mL三角瓶中裝液量分別為25、50、75、100和125 mL，發(fā)酵溫度為32℃，初始pH 7.0，發(fā)酵時(shí)間48 h。

2 結(jié)果與分析

2.1菌株分離篩選

通過富集培養(yǎng)，從土壤中篩選出5株能在以1%泡葉藻為唯一營養(yǎng)物質(zhì)的平板上快速生長的菌株，挑取單菌落進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，對(duì)生長速度及菌數(shù)進(jìn)行比較。結(jié)果表明，菌株2-2在1%泡葉藻培養(yǎng)基中生長穩(wěn)定且菌數(shù)較高。如圖1所示，1%泡葉藻液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40 h后泡葉藻細(xì)胞細(xì)胞壁被降解，故選擇2-2作為下一步研究的菌株。

圖1 泡葉藻降解前后變化Fig.1 Change of Ascophyllum nodosum degradated by strain 2-2

2.2菌株2-2鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征菌株2-2在初篩平板上培養(yǎng)48 h后，菌落呈圓形，乳白色，不透明，邊緣整齊，表面光滑濕潤，隆起。菌株2-2為桿狀，鏈狀生長，有芽孢，芽孢端生，無鞭毛，革蘭氏染色陽性。

圖2 菌株2-2的光學(xué)顯微鏡圖Fig.2 The morphology of strain 2-2 under light microscope

2.2.2生理生化特性菌株2-2的生理生化結(jié)果如表1所示。

表1 菌株2-2的主要生理生化特征Table 1 The main physiological and chemical characteristics of strain 2-2

2.2.3 16S rDNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析測(cè)序得到菌株2-2的16S rDNA基因序列含有1396 bp。系統(tǒng)發(fā)育樹表明（圖3），菌株2-2與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）親緣關(guān)系最近。同時(shí)結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性，將其歸類為芽孢桿菌屬，巨大芽孢桿菌。

圖3 菌株2-2與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain 2-2

2.3發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 碳源對(duì)菌株發(fā)酵的影響主要研究了不同碳源對(duì)菌株發(fā)酵的影響，研究表明，碳源選用葡萄糖時(shí)，菌數(shù)最高，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了不同濃度的葡萄糖對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，當(dāng)葡萄糖濃度為4 g/L時(shí)，纖維素酶和海藻膠裂解酶的酶活最高，過多的葡萄糖會(huì)使菌數(shù)增加，但不利于誘導(dǎo)酶的分泌。

圖4 不同碳源對(duì)菌株發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on the number of fermentation broth

表2 葡糖糖濃度對(duì)菌數(shù)和酶活的影響Table 2 Effect of different concentration of glucose on the number of fermentation broth and enzyme activity

2.3.2 氮源對(duì)菌株發(fā)酵的影響氮源是微生物生長和代謝所需營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源，也是構(gòu)成酶的重要成分。本文除添加泡葉藻和碳源外，選取無機(jī)氮源和有機(jī)氮源進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，選用酵母粉為氮源時(shí)，菌株菌數(shù)最高。進(jìn)一步研究了不同濃度的酵母粉對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，當(dāng)酵母粉濃度為6 g/L時(shí)，蛋白酶和海藻膠裂解酶的酶活最高，過多的酵母粉會(huì)使菌數(shù)增加，但不利于蛋白酶和海藻膠裂解酶的分泌。

圖5 不同氮源對(duì)菌株發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on the number of fermentation broth

表3 酵母粉濃度對(duì)菌數(shù)和酶活的影響Table 3 Effect of different concentration of yeast extract on fermentation and enzyme activity

2.3.3 泡葉藻添加量對(duì)菌株發(fā)酵的影響泡葉藻含量分別為0 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L和50 g/L，另外加入5 g/L葡萄糖和5 g/L酵母粉，發(fā)酵48 h后，已完全產(chǎn)生芽孢。菌數(shù)如圖所示。在泡葉藻添加量為30 g/L時(shí)，菌數(shù)最高，生長狀況最好。

圖6 泡葉藻添加量對(duì)菌株發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of different concentration of ascophyllum nodosum on the number of fermentation broth

圖7 pH對(duì)菌株發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of different pH on the number of fermentation broth

2.3.4 初始pH對(duì)菌株2-2的影響培養(yǎng)基初始pH直接影響著菌體細(xì)胞的通透性、穩(wěn)定性以及代謝產(chǎn)物酶系的活性，而且通過影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，間接影響著微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。研究顯示，菌株2-2生長、產(chǎn)酶最適pH為7.5，這與海藻膠裂解酶的適宜pH均為6-8相一致[12]。

2.3.5 發(fā)酵溫度對(duì)菌株2-2的影響菌體細(xì)胞的生長及酶的合成是由一系列嚴(yán)格有序的生化反應(yīng)組成，而生化反應(yīng)受溫度影響較大，所以溫度對(duì)菌體細(xì)胞的生長和產(chǎn)酶具有顯著的影響。將菌株在不同溫度下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果顯示，菌株2-2的最佳培養(yǎng)溫度是32℃。

圖8 溫度對(duì)菌株發(fā)酵的影響Fig.8 Effect of different fermentation temperature on the number of fermentation broth

圖9 加液量對(duì)菌株發(fā)酵的影響Fig.9 Effect of different liquid volume on the number of fermentation broth

2.3.6 裝液量對(duì)菌株2-2的影響裝液量是制約菌種生長及產(chǎn)酶的一個(gè)重要因素。裝液量過少，水分易揮發(fā)，過大則溶氧降低，影響菌體生長，導(dǎo)致產(chǎn)酶下降。于在250 mL三角瓶中分別加入25、50、75、100、125 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，研究裝液量對(duì)菌株2-2的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，裝液量為50 mL時(shí)，菌體生長狀況最好。

2.4酶活力測(cè)定

泡葉藻內(nèi)含有39.8～45%的海藻膠和其他碳水化合物、6～7%的纖維素和5～6%的蛋白質(zhì)，故本研究通過測(cè)定發(fā)酵液的海藻膠裂解酶、纖維素酶和蛋白酶的酶活作為衡量菌株活性的標(biāo)準(zhǔn)。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基泡葉藻10 g/L，pH 7.0，32℃培養(yǎng)時(shí)，48 h后，菌數(shù)為8.2×107CFU/mL纖維素酶活為12 U/mL，蛋白酶活為0.4 U/mL，海藻膠裂解酶活為0.0047 U/mL。調(diào)節(jié)發(fā)酵配方后，泡葉藻30 g/L，葡萄糖4 g/L，酵母粉6 g/L，pH 7.5，48 h后，菌數(shù)為2.4×109CFU/mL，纖維素酶活為47.7 U/mL，蛋白酶活為3.4 U/mL，海藻膠裂解酶活為0.721 U/mL，酶活均有明顯提高。

3 討論

本研究以泡葉藻為唯一營養(yǎng)物質(zhì)，從土樣中篩選出一株能降解泡葉藻的菌株2-2，泡葉藻組織經(jīng)菌株2-2發(fā)酵降解后有明顯的變化，細(xì)胞壁破裂。通過形態(tài)特征，生理生化特征及16s rDNA序列分析對(duì)菌株2-2進(jìn)行種屬鑒定，將其鑒定為巨大芽孢桿菌。

目前關(guān)于海藻降解的研究一般是集中于海藻膠的降解，如詹冬梅等[13]、劉玉佩等[14]和湯海青等[15]通過以海藻酸鈉為唯一碳源篩選出具有海藻膠裂解酶活性的菌株，本研究以泡葉藻勻漿為唯一營養(yǎng)物質(zhì)，泡葉藻內(nèi)含有菌株生長所需要的碳源、氮源及無機(jī)鹽，篩選出的菌具有海藻膠裂解酶活性，同用Preiss方法檢測(cè)海藻膠裂解酶活性，菌株2-2的酶活性與以上篩選出的酶活性相當(dāng)。此外菌株2-2還具有纖維素酶活性和蛋白質(zhì)酶活，纖維素酶活性比沈雪亮[16]、李振紅等[17]篩選的纖維素降解菌的酶活稍高。蛋白酶活與已報(bào)道的高產(chǎn)酶菌株酶活力還有一定的差距[18-19]，可以通過誘變育種等手段進(jìn)行改造，提高蛋白酶活。菌株2-2有海藻膠裂解酶活、纖維素酶活和蛋白酶活，這為降解泡葉藻奠定了基礎(chǔ)。

菌株2-2為巨大芽孢桿菌，但未見該種具有海藻膠裂解酶活性的報(bào)道。說明本研究分離到了比較新穎的資源菌株。另外，有關(guān)巨大芽孢桿菌研究內(nèi)容包括污水處理、農(nóng)藥降解、生物堆肥、微生物肥料等，近年來關(guān)于巨大芽孢桿菌用于土壤解磷的研究日益增多[20-21]。本研究中篩選到的巨大芽孢桿菌是否土壤解磷的功效，有待進(jìn)一步的研究。

研究表明，菌株2-2可以通過發(fā)酵降解泡葉藻，以海藻為養(yǎng)分的代謝過程中產(chǎn)生多種酶，最大限度的保證了海藻內(nèi)的生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)。在作為海藻肥料時(shí)，將具有良好的應(yīng)用前景。目前對(duì)生物法降解海藻的研究還處于試驗(yàn)階段，發(fā)酵工藝及生物法降解的海藻肥料的應(yīng)用效果需進(jìn)行深入研究，為大工業(yè)生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Isolation and Fermentation Optimization of anAscophyllum Nodosum Degrading Strain

LIU Lu,GONG Chun-yan,ZHAO Hong-tao,WANG Peng,LI Yuan-yuan*
Qingdao Mingyue BlueOcean Bio-technology Co.Ltd.,Qingdao 266400,China

To study ascophyllum nodosum degradated by microorganism,a high efficient microorganism was isolated from soil using ascophyllum nodosum as the sole nutrient.Based on the morphological,physiological characteristics and 16S rDNA sequence,the strain was identified asBacillus megaterium.The optimized fermentation medium was composed of ascophyllum nodosum 30 g/L,yeast extract 6 g/L and glucose 4 g/L.The optimal culture condition was that the strain was cultured in 250 mL shake flakes containing 25 mL medium with initial pH 7.5 at 32℃.After 48 h fermentation,the effective number of viable cells was 2.4×109CFU/mL,the activity of cellulose was 47.7 U/mL,the activity of protease was 3.4 U/mL, and the activity of alginate lyase was 0.721 U/mL.Possessing the activity of alginate lyase,cellulose and protease,Bacillus megaterium2-2 was conferred extensive potential applications.

Ascophyllum nodosum degrading bacteria;Bacillus megaterium;alginate lyase;fermentation optimization

Q936

A

1000-2324(2014)04-0515-07

2013-02-22

2013-04-14

劉露(1987-),女,山東濟(jì)南人,工學(xué)碩士.研究方向:從事海洋功能性農(nóng)用生物制品開發(fā).E-mail:myhzfliulu@126.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:myhzflyy@126.com