鄒蓉,蔣運(yùn)生,史艷財(cái),孔德鑫,王滿蓮

廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所,廣西桂林541006

黃根總黃酮提取工藝研究

鄒蓉,蔣運(yùn)生,史艷財(cái),孔德鑫,王滿蓮

廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所,廣西桂林541006

以黃根為試材，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，考察超聲波頻率、超聲波功率、乙醇濃度、提取時(shí)間、固液比、提取溫度對黃根總黃酮提取率的影響，以優(yōu)化超聲波提取黃根中總黃酮的工藝條件。結(jié)果表明，最佳提取工藝：超聲波頻率為高頻（61 KHz），超聲波功率為60 W，乙醇濃度100%，提取時(shí)間105 min，固液比1:15，提取溫度65℃。另外，同一產(chǎn)地黃根植株不同部位總黃酮含量高低順序大致為，結(jié)果植株：根＞葉＞莖＞側(cè)枝；不結(jié)果植株：葉＞根＞莖＞側(cè)枝。試驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定、重復(fù)性好，為黃根中總黃酮成分的提取提供了試驗(yàn)依據(jù)。

黃根;單因素;正交試驗(yàn);提取工藝

黃根(Prismatomeris tetrandra(Roxb.)K.Schum.)又名四蕊三角瓣花，為茜草科三角瓣花屬植物，藥用根。分布于廣東、海南、廣西、云南等地。具有祛瘀生新、強(qiáng)壯筋骨、利濕退黃等功效，民間用其治療肝炎、再生障礙性貧血[1]，有抗乙肝病毒作用[2]和抗肝纖維化作用[3]，對治療地中海貧血[4]、矽肺[5-7]、石棉肺[8,9]均有顯著的療效。近年來，隨著對黃根藥理作用研究的深入，對黃根資源的使用也不斷增加。本文通過單因素和正交試驗(yàn)對黃根總黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究，為了解黃根中黃酮類物質(zhì)的含量,以便更全面、綜合地評(píng)價(jià)及合理開發(fā)這一藥用植物提供參考。

1 儀器和材料

供試黃根植株為采自廣西壯族自治區(qū)防城港市防城區(qū)，經(jīng)廣西植物研究所蔣運(yùn)生研究員鑒定為茜草科黃根，蒸餾水洗凈，晾干表皮后分為結(jié)果（根、莖、側(cè)枝、葉），不結(jié)果（根、莖、側(cè)枝、葉）后在干燥箱中干燥，研磨成粉末，過60目篩后裝入封口袋干燥保存。本試驗(yàn)測量總黃酮含量所用的樣品均為結(jié)果植株的莖。

供試試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：MUST-12040302，中國藥品生物制品檢定所）；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水；乙醇等試劑均為分析純。

供試儀器：TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；DL-720E智能超聲波；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

2 方法和結(jié)果

2.1樣品預(yù)處理

稱取黃根干燥粉末0.5 g，加50%乙醇10 mL，40℃水浴提取30 min，超聲波頻率為高頻（61 KHz），超聲波功率180 W。提取結(jié)束后過濾，洗滌液合并，定容至50 mL，即得供試品溶液。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取蘆丁對照品20.0 mg,置50 mL容量瓶中,50%乙醇溶解，制成0.4 mg/mL的對照品溶液。分別取制備好的對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL及提取液1 mL，置于25 mL容量瓶中，加50%乙醇至10 mL，加5%亞硝酸鈉1 mL，混勻，靜置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，靜置6 min；加4%氫氧化鈉溶液10 mL，50%乙醇調(diào)至刻度，混勻，得空白液、對照品溶液及樣品供試液。靜置15 min后在190～900 nm進(jìn)行光譜掃描。確定選用500 nm作為測定波長。以總黃酮濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)繪制回歸曲線，回歸方程為Y=0.1201X-0.0057（R2=0.9996），說明在總黃酮濃度為0.0016～0.016 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3總黃酮測定

取2.1項(xiàng)中提取液1 mL置于25 mL容量瓶中，以下操作同2.2。測其在500 nm處的吸光度，計(jì)算出總黃酮質(zhì)量。總黃酮含量計(jì)算方法為：總黃酮含量(%)=(黃酮類物質(zhì)質(zhì)量/干物料質(zhì)量)×100%[11]。

2.4提取方法實(shí)驗(yàn)

2.4.1 超聲波頻率對提取率的影響精密稱取黃根粉末0.5 g，按固液比20倍加入50%的乙醇10 mL，40℃水浴中提取30 min，超聲波功率為180 W，超聲波頻率分別為高頻（61 kHz）和低頻（35 kHz）。過濾，定容至50 mL，測定其吸光度，計(jì)算總黃酮含量。超聲波高頻61 kHz時(shí)的總黃酮提取率（0.25%）高于低頻35 kHz時(shí)的提取率（0.19%），故超聲波頻率選用高頻61 KHz。

2.4.2 超聲波功率對黃根總黃酮提取率的影響精密稱取黃根粉末0.5 g，按固液比20倍加入50%的乙醇10 mL，40℃水浴中提取30 min，超聲波功率分別為60、180、300、420、540 W，超聲波頻率為高頻（61 KHz）。過濾，定容至50 mL。測定其吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果如表1所示。隨著超聲波功率增大，總黃酮提取率呈下降趨勢，在功率60 W時(shí)，總黃酮提取率最高。超聲波最佳功率為60 W。

表1 超聲波功率對提取率的影響Table 1 The effect of ultrasonic wave on extraction rate

2.4.3 提取溫度對黃根總黃酮提取率的影響精密稱取黃根粉末0.5 g，按固液比20倍加入50%的乙醇10 mL，分別在30、50、60、70、90℃水浴中提取30 min，超聲波功率為60 W，超聲波頻率為高頻（61 KHz）。過濾，定容至50 mL。測定其吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果如表2所示?？傸S酮提取率隨提取溫度變化規(guī)律是先升高，后降低。當(dāng)提取溫度為60℃時(shí)，總黃酮提取率最高。確定最佳提取溫度是60℃。

表2 提取溫度對提取率的影響Table 2 The effect of temperature on extraction rate

2.4.4 乙醇濃度對黃根總黃酮提取率的影響精密稱取黃根粉末0.5 g，按固液比20倍分別加入20、40、60、80、100%的乙醇10 mL，60℃水浴中提取30 min，超聲波功率為60 W，超聲波頻率分別為高頻（61 KHz）。過濾，定容至50 mL。測定其吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果如表3所示?？傸S酮提取率隨乙醇濃度的增加而增加，高濃度的乙醇更有利于總黃酮的溶出。選擇100%乙醇為最佳濃度。

表3 乙醇濃度對提取率的影響Table 3 The effect of Ethanol concentration on extraction rate

2.4.5 固液比對黃根總黃酮提取率的影響精密稱取黃根粉末0.5 g，分別按固液比20、30、40、50、60倍加入100%的乙醇10 mL，60℃水浴中提取30 min，超聲波功率為60 W，超聲波頻率為高頻（61 KHz）。過濾，定容至50 mL。測定其吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果如表4所示。隨著固液比的加大，總黃酮提取率逐漸降低。但過小的料液比不利于乙醇完全浸透樣品，提取中容易粘附于瓶壁上。選擇固液比為1:20。

表4 固液比對提取率的影響Table 4 The effect of solid and liquid ratio on extraction rate

2.4.6 提取時(shí)間對黃根總黃酮提取率的影響精密稱取黃根粉末0.5 g，按固液比20倍加入100%的乙醇10 mL，60℃水浴中分別提取10、30、60、90、120 min，超聲波功率為60 W，超聲波頻率為高頻（61 KHz）。過濾，定容至50 mL。測定其吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果如表5所示。隨提取時(shí)間的的延長，總黃酮提取率也逐漸升高。故選擇最佳提取時(shí)間為120 min。

表5 提取時(shí)間對提取率的影響Table 5 The effect of time on extraction rate

2.4.7 正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)考察乙醇濃度、提取時(shí)間、固液比、提取溫度對總黃酮提取率的影響，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)因素及水平、正交試驗(yàn)結(jié)果、正交試驗(yàn)方差分析分別如表6、7、8所示?？疾斓?因素中，對總黃酮提取率影響大小順序依次為C＞D＞B＞A，即固液比＞提取溫度＞提取時(shí)間＞乙醇濃度。由直觀分析得出的最佳提取組合是A2B2C1D3，正交試驗(yàn)中總黃酮提取率最高的是組合是A3B2C1D3，因乙醇濃度對提取率影響最小，在試驗(yàn)中可做適當(dāng)調(diào)整，試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析結(jié)果相一致。由表8可知，各因素對總黃酮提取率的影響均未達(dá)到顯著水平。確定最佳提取工藝為A3B2C1D3，即乙醇濃度100%，提取時(shí)間105 min，固液比15，提取溫度65℃。

表6 因素水平表Table 6 Factor level

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析Table 7 Result and intuitive analysis of experiment

表8 正交試驗(yàn)方差分析Table 8 Variance analysis on orthogonal experiment

2.5黃根不同部位總黃酮含量比較

分別稱取不同部位的黃根干品0.5 g，按照篩選出的最佳提取工藝條件進(jìn)行總黃酮提取測定，結(jié)果見表9。從表9中可以看出，結(jié)果的植株總黃酮含量高低順序?yàn)椋焊救~＞莖＞側(cè)枝；不結(jié)果植株總黃酮含量高低順序?yàn)椋喝~＞根＞莖＞側(cè)枝。其中不結(jié)果植株的葉含量最高達(dá)1.74%，其次為不結(jié)果植株的根1.16%，結(jié)果植株的側(cè)枝近0含量。

表9 黃根不同部位黃酮含量Table 9 Flavonoids content in the different parts of Prismatomeris tetrandra

2.6驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述確定的最佳提取工藝進(jìn)行5次試驗(yàn)，5次試驗(yàn)得到提取液中總黃酮含量平均為5.35%，RSD=1.13%，表明確定的提取工藝穩(wěn)定、可靠。

2.7精密度試驗(yàn)

吸取蘆丁對照品溶液1 mL，照“2.2項(xiàng)”步驟操作，連續(xù)測定5次，吸光度值RSD=0.85%，表明試驗(yàn)精密度良好。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

稱取6份同一樣品，按“2.2項(xiàng)”方法制備供試品溶液。按“2.3項(xiàng)”方法測定吸光值，得吸光值RSD=1.03%，表明試驗(yàn)重復(fù)性較好。

2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取某一供試液，按“2.2項(xiàng)”方法每隔30 min測定一次吸光度，共測5次，得吸光值RSD=1.46%，表明樣品在120 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.10加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知總黃酮含量的提取液5份，分別加入一定量的蘆丁對照品，按“2.2項(xiàng)”方法制備供試液，測定吸光度，得平均回收率為97.94%，RSD=1.13%。

3 討論

傳統(tǒng)的黃酮類化合物提取手段有水提法、系統(tǒng)溶液提取法有機(jī)、溶劑提取法、堿性水或堿性稀醇提取法等，可根據(jù)提取物的性質(zhì)、提取成本、工藝設(shè)備等條件來選擇最適合的提取工藝，提高黃酮類物質(zhì)的提取率，增大原料的利用效果。與傳統(tǒng)提取方法相比，超聲波提取法提高了黃酮類物質(zhì)的提取率和純度，所用時(shí)間短，要求溫度低，具有明顯的優(yōu)勢。本試驗(yàn)以黃根中總黃酮提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)選用超聲波提取黃根總黃酮的工藝參數(shù)：乙醇濃度100%，提取時(shí)間105 min，固液比15，提取溫度65℃，超聲波頻率和功率分別為61 KHz和60 W。

傳統(tǒng)用藥時(shí)黃根的根部。本試驗(yàn)表明，在同一產(chǎn)地，不同時(shí)期，不同部位的總黃酮含量有比較大的差別的。結(jié)果植株：根＞葉＞莖＞側(cè)枝;

不結(jié)果植株：葉＞根＞莖＞側(cè)枝。其中不結(jié)果植株的葉總黃酮含量最高，達(dá)1.74%，而結(jié)果植株莖的含量為0。相同植株中根與葉的總黃酮含量相對較高，說明其葉也許具有較大的藥用價(jià)值，能否采用葉作為治病的原材料有待進(jìn)一步深入研究。

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StudyontheExtractionConditionofFlavonoidinPrismatomeritetrandra

ZOU Rong,JIANG Yun-sheng,SHI Yan-cai,KONG De-xin,WANG Man-lian
GuangxiKeyLaboratoryofFunctionalPhytochemicalsResearchandUtilization,GuangxiInstituteofBotany,Guilin541006,China

TakingPrismatomeri tetrandraas material,using the method of single factor test and orthogonal test,the effect of ultrasonic frequency,ultrasonic power,alcohol concentration,extracting time,ratio of solid and liquid on extracting rate and extracting temperature of flavonoid fromPrismatomeri tetrandrawere studied to optimize extracting technique.The results showed that the optimal extracting conditions were ultrasonic frequency 61 kHz,ultrasonic power 60 W,alcohol concentration 100%,extracting time105 min,the ration of solid and liquid 1:15 g/mL,extracting temperature 65℃.On the other hand,quantitative order of flavonoid in different sections ofPrismatomeri tetrandrafrom the same area was,results plants:root＞leaf＞stem＞collateral;fruitless plants:leaf＞root＞stem＞collateral.The stability and repeatability of this technique were good.It could provide the basis for extracting flavonoid fromPrismatomeri tetrandra.

Prismatomeri tetrandra;single factor test;orthogonal test;extraction technology

Q946.83

A

1000-2324(2014)05-0651-05

2013-04-11

2013-04-26

廣西科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(桂科攻11107010-2-3)

鄒蓉(1982-),女,廣西全州人,助理研究員,主要從事藥用植物生理生態(tài)等研究.E-mail:zourong@gxib.cn