周立,劉裕紅,賈俊

復(fù)合酶法提取金銀花多糖及其抗氧化性

周立1*,劉裕紅1,賈俊2

1.貴陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院,貴州貴陽550000
2.貴陽護(hù)理職業(yè)學(xué)院,貴州貴陽550000

本文旨在優(yōu)化金銀花多糖的復(fù)合酶法提取工藝，并評價(jià)金銀花多糖的抗氧化活性。以不同復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶)配比、液料比、pH、酶解溫度、酶解時(shí)間為試驗(yàn)因素，以金銀花多糖得率為考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)篩選復(fù)合酶法提取的最佳工藝條件；采用自由基清除能力體系評價(jià)金銀花多糖的抗氧化活性。結(jié)果表明，復(fù)合酶最佳配比為纖維素酶2.0%，果膠酶2.0%，木瓜蛋白酶0.5%；復(fù)合酶酶解金銀花提取多糖的工藝條件為液料比25:1(mL/g)、pH為4.5、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間60 min，在此條件下金銀花多糖得率為12.36%；金銀花多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對DPPH和O2-·自由基的半數(shù)抑制濃度分別為0.811 mg/mL、1.363 mg/mL，但與維生素C比較，抗氧化活性較弱。金銀花多糖提取工藝方便可行，得率較高，提取到的多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

金銀花;多糖;復(fù)合酶;酶法提取;抗氧化活性

天然植物多糖具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、免疫等生物活性、副作用小等優(yōu)勢，越來越受到研究者的重視[1,2]，如從土茯苓[3]、桃金娘[4]、紅雪茶[5]等植物中提取多糖。金銀花(Lonicera japonica)屬忍冬科，中醫(yī)認(rèn)為，金銀花可清熱解毒、涼散風(fēng)熱，對癰腫疔瘡、熱毒血痢、喉痹、風(fēng)熱感冒等有一定療效[6]。對于金銀花多糖的提取多采用水提法、超聲波法、水提醇沉法，但多糖得率較小，而周小楠等采用纖維素酶法提取金銀花多糖，得率可達(dá)到11.3%[7]。鑒于酶法可顯著提升多糖得率，且未見復(fù)合酶法提取金銀花多糖及其抗氧活性的相關(guān)報(bào)道，本試驗(yàn)探討復(fù)合酶提取金銀花多糖的最佳工藝條件，同時(shí)采用自由基清除能力體系評價(jià)其體外抗氧化活性，為金銀花多糖的進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

金銀花購自中草藥市場，烘干至恒重備用；纖維素酶(15 U/mg)上海博奧生物科技；木瓜蛋白酶(650 U/mg)北京奧博星生物技術(shù)；果膠酶(500 U/mg)廣州齊云生物科技；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、D-無水葡萄糖、維生素C(VC)美國Sigma；濃硫酸、苯酚、三氯乙酸(TCA)等均為分析純。

UV755B紫外分光光度計(jì)深圳瑞鑫達(dá)；PHS-3E酸度計(jì)上海精科；高速萬能粉碎機(jī)北京長峰金鼎；電熱鼓風(fēng)干燥箱上海煜南儀器；離心機(jī)德國eppendorf；HL-2恒流泵上海滬西；HSY-B雙功能水浴恒溫?fù)u床金壇市精達(dá)儀器。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金銀花多糖的提取精確稱取5.0 g粉碎并過100目篩后的金銀花粉，按設(shè)定酶解條件(液料比、酶解溫度、pH、酶解時(shí)間、復(fù)合酶配比)，在180 r/min搖床上進(jìn)行酶解提取實(shí)驗(yàn)，得到多糖浸提液。多糖浸提液經(jīng)90℃高溫滅活、離心分離、抽濾濃縮、三氯乙酸法除蛋白、透析除雜、乙醇沉淀、冷凍干燥一系列步驟，最終得到金銀花多糖。

1.2.2 多糖含量的測定多糖測定采用苯酚-硫酸法[8]。以葡萄糖(mg/mL)作為標(biāo)準(zhǔn)品測定提取液中多糖液中金銀花多糖的含量，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0167x-0.0469，R2=0.9941，式中y為吸光度、x為葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)。金銀花多糖得率計(jì)算如下：Y(%)=[(A×B)/C]×100，式中：Y為多糖得率(%)；A為由回歸方程求得的多糖濃度(mg/mL)；B為多糖液體積(mL)；C為金銀花質(zhì)量(g)。

1.2.3 酶種類對金銀花多糖提取的單因素試驗(yàn)參考周小楠等[7]研究結(jié)果，固定酶解pH5.0、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間50 min、液料比20:1、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min條件不變，分別選取纖維素酶、木瓜蛋白酶和果膠酶，酶添加量均為1.5%，考察酶種類對多糖得率的影響，以多糖得率為指標(biāo)并與90℃熱水浸提法(時(shí)間50 min、液料比20:1)進(jìn)行比較。

1.2.4 復(fù)合酶配比正交優(yōu)化設(shè)計(jì)其它條件同1.2.3部分，研究復(fù)合酶的不同用量對金銀花多糖提取的影響，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of the complex enzyme in orthogonal experimental design

1.2.5 提取條件正交優(yōu)化設(shè)計(jì)根據(jù)復(fù)合酶配比正交實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以料液比、pH、酶解溫度、酶解時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，研究最優(yōu)的提取工藝條件，因素水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Factors and levels of the extraction condition in orthogonal experimental design

1.2.6 金銀花多糖體外抗氧化活性測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力測定取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2 mL和2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)混勻，反應(yīng)30 min后在517 nm處測定其吸光度A1，同法測定2.0 mL乙醇加樣液的吸光度A2，以及2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL蒸餾水的吸光度A0，以VC作為對照[9]。樣品對DPPH自由基的清除率計(jì)算公式為：Y(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。1.2.6.2 O2-·的清除能力測定取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1.0 mL，加入pH8.2、濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液4.0 mL，25℃水浴10 min，再加入0.1 mL濃度為25 mmol/L的鄰苯三酚，混勻保溫5 min后，即刻加入2滴10 mol/L的HCl終止反應(yīng)，讀取溶液在波長325 nm處的吸光度B1，同法測定用蒸餾水代替鄰苯三酚后的吸光度B2，及以1.0 mL蒸餾水替代樣品溶液后的吸光度B0，以VC作為對照[10]。樣品對O2-·的清除率計(jì)算公式為：Y(%)=[1-(B1-B2)/B0]×100。

2 結(jié)果與分析

2.1酶種類對多糖提取的影響

結(jié)果如圖1所示，纖維素酶解提取金銀花多糖得率10.52%是熱水浸提法的2.62倍，且大于木瓜蛋白酶和果膠酶的多糖得率。纖維素酶能夠破壞胞壁結(jié)構(gòu)，使胞內(nèi)和胞壁中的多糖物質(zhì)溶出，故纖維素酶得率最大。

圖1 酶種類對多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzymes on the extraction rate of polysaccharide

2.2正交優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 復(fù)合酶配比試驗(yàn)結(jié)果及分析結(jié)果見表3，根據(jù)極差R值大?。≧A＞RC＞RB），影響金銀花多糖得率的復(fù)合酶順序?yàn)槔w維素酶＞木瓜蛋白酶＞果膠酶；空列RD值代表試驗(yàn)誤差及交互作用的影響，其中RD＜RA說明纖維素酶是金銀花多糖提取的主要影響因素，而RD＞RB、RD＞RC代表果膠酶和木瓜蛋白酶對多糖提取影響不大。正交試驗(yàn)結(jié)果確定，復(fù)合酶最佳酶配比為A3B3C1，即纖維素酶為2.0%，果膠酶為2.0%，木瓜蛋白酶為0.5%。

表3 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test on the complex enzyme

2.2.2 提取條件試驗(yàn)結(jié)果及分析結(jié)果見表4，極差分析可知，各因素對金銀花多糖得率的影響大小順序?yàn)椋篈＞C＞B＞D，即液料比對金銀花粗多糖提取的影響最大，其次是酶解溫度，影響較小的是pH和酶解時(shí)間。得出的最佳提取工藝條件為A3B1C2D3，即最佳液料比為25:1，pH為4.5，溫度為50℃，酶解時(shí)間為60 min。

表4 提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test on the extraction condition

2.3工藝優(yōu)化后的驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)正交試驗(yàn)優(yōu)化后的工藝可靠性，在上述最佳復(fù)合酶配比及最佳工藝提取條件下，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，所得多糖得率分別為11.85%、12.13%、13.10%，平均值為12.36%。

2.4金銀花多糖體外抗氧化活性

2.4.1 多糖對DPPH自由基清除作用由圖2可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，樣品溶液多糖和VC對DPPH自由基清除率不斷增大，多糖質(zhì)量濃度10 mg/mL時(shí)，樣品溶液多糖對DPPH自由基清除率達(dá)到85.37%，具有較強(qiáng)清除DPPH自由基的能力，但比VC清除DPPH自由基的能力差。金銀花多糖清除50%DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.811 mg/mL，VC的IC50為0.572 mg/mL。

圖2 樣品多糖和VC對DPPH自由基的清除作用Fig.2 Scavenging capacity of sample polysaccharide and vitamin C on DPPH free radicals

2.4.2 多糖對O2-·清除作用由圖3可知，當(dāng)濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，O2-·的清除率為85.02%，說明金銀花多糖具有較強(qiáng)的清除O2-·的能力。VC在質(zhì)量濃度0.2～10 mg/mL范圍內(nèi)，對O2-·的清除增加較快，0.8 mg/mL清除率達(dá)到84.75%，因此金銀花多糖與VC相比清除能力較弱，金銀花多糖清除O2-·的IC50為1.363 mg/mL，VC的IC50為0.503 mg/mL。

圖3 樣品多糖和VC對O2-·的清除作用Fig.3 Scavenging capacity of sample polysaccharide and vitamin C on superoxide anion free radicals

3 結(jié)論

本研究考察了復(fù)合酶配比、酶解pH、液料比、酶解溫度及酶解時(shí)間對金銀花多糖提取的影響。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了纖維素酶、木瓜蛋白酶提取金銀花多糖的最佳工藝條件為：纖維素酶添加量2.0%，果膠酶添加量2.0%，木瓜蛋白酶添加量0.5%；液料比25:1、pH為4.5、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間60 min，此條件下多糖得率為12.36%，高于已發(fā)表的相關(guān)報(bào)道，如張玉等水提醇沉法提取金銀花多糖，得率為4.87%[11]；趙鵬等采用超聲提取，得率僅為3.26%[12]。此外，提取條件中影響金銀花多糖得率的因素按主次順序依次為液料比＞酶解溫度＞酶解pH＞酶解時(shí)間。

金銀花多糖對DPPH自由基和O2-·具有一定的清除作用，并與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，對DPPH自由基的清除率為85.37%，對O2-·的清除率為85.02%，但與VC比較，金銀花多糖清除兩種自由基的能力較弱。金銀花多糖對DPPH自由基和O2-·的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.811 mg/mL、1.363 mg/mL。

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Extraction Process of Polysaccharide from Lonicera japonica with Compound Enzyme Treatment and Its AntioxidantActivity

ZHOU Li1*,LIU Yu-hong1,JIAJun2
1.Guiyang Vocational and Technical College,Guiyang 550000,China
2.Guiyang Nursing Vocational College,Guiyang 550000,China

In order to optimize the compound enzymatic extraction technology of polysaccharide from Lonicera japonica and and investigate its antioxidant activity.The experiments used polysaccharides extraction rate as response value,and used enzymatic hydrolysi(cellulose,pectinase,papain),the ratio of water to material,pH,extraction temperature and extraction time as experimental factors to optimize the polysaccharide extraction conditions from Lonicera japonica.Antioxidant activity of polysaccharides was measured by DPPH and O2-·free radical elimination method.The best ratio of compound enzyme was 2.0%cellulase,2.0%pectinase,0.5%papain.The optimum conditions were as follows,the ratio of water to feedstock was 25 mL/g,pH4.5,extraction temperature was 50℃,extraction time was 60 min.Under the optimal conditions, the experimental extraction rate was 12.36%.IC50of DPPH and O2-·were 0.811 mg/mL and 1.363 mg/mL,respectively. Antioxidant activity of sample polysaccharides was weaker than those of vitamin C.The optimum compound enzymatic extraction technology of the polysaccharides from Lonicera japonica was convenient and feasible,the polysaccharides extraction rate was higher than other extraction methods,and the extracted polysaccharides had good antioxidant activity.

Lonicera japonica;polysaccharide;compound enzymes;enzymatic extraction;antioxidant activities

Q539

A

1000-2324(2014)05-0646-05

2012-12-20

2013-02-15

周立(1982-),男,講師,碩士,主要從事藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和藥物分析.E-mail:inaturet@sina.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:inaturet@sina.com