馬桂香,門中華

氮素對大豆硝酸還原酶及根系活力的影響

馬桂香,門中華

包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭014030

本文以東農(nóng)48和合豐45大豆品種為試驗(yàn)對象，采用盆栽試驗(yàn)及室內(nèi)生理測定方法，對不同氮素水平下各生育期大豆硝酸還原酶和根系活力變化進(jìn)行了研究。試驗(yàn)結(jié)果表明：兩個(gè)大豆品種在不同氮素劑量處理下，體內(nèi)的硝酸還原酶和根系活力具有明顯的變化，而同一劑量的不同生育期硝酸還原酶和根系活力也有差異，主要表現(xiàn)在結(jié)莢期硝酸還原酶最高，苗期根系活力最高。綜合分析表明：適宜的氮素水平可以刺激硝酸還原酶和根系活力提高，從而促進(jìn)植物對養(yǎng)分吸收以及光合作用積累。

氮素;大豆;硝酸還原酶;根系活力

氮素是植物生長發(fā)育和新陳代謝必不缺少的營養(yǎng)元素之一，也是蛋白質(zhì)、葉綠素及其他有機(jī)分子的基本組成元素[1]。硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）是植物氮素同化過程中最重要的一個(gè)限速酶和誘導(dǎo)酶，對植物氮素代謝起著至關(guān)重要的作用，豆科植物獲取氮的途徑主要依靠NO3-的同化，植物當(dāng)中HR活性越高，對氮素利用效果就越好[2,3]。

根系活力是影響植物對水分和肥料吸收和運(yùn)輸，是促進(jìn)光合物質(zhì)的形成的一個(gè)生理指標(biāo)。葛文婷[4]等研究認(rèn)為，HR在大豆?fàn)I養(yǎng)生長期活性較低，在結(jié)莢盛期活性較高，而李豪哲[5,6]等在研究指出，不同大豆葉片品種HR活力與籽粒蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)的趨勢。目前國內(nèi)外有關(guān)根系活力研究主要集中在干旱、鹽堿等方面，在大豆氮素和根系活力的相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。

因此，本文采取盆栽方法，系統(tǒng)了研究在不同氮素水平下，大豆各生育期HR以及根系活力的變化情況，尋找氮素最佳施用時(shí)期，旨在為今后合理施用氮肥及豐富植物育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料

1.1.1 供試材料供試大豆材料東農(nóng)48是由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆科學(xué)研究所育成；合豐45是由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院合江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成，試驗(yàn)材料均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所提供。

1.1.2 供試土壤供試土壤取自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田，試驗(yàn)土壤情況見表1。

表1 試驗(yàn)地土壤總體情況Table1 Traits of experimental soil

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2012年在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)站進(jìn)行，試驗(yàn)采用盆栽，規(guī)格為高度30 cm，寬度為25 cm的塑料桶，每盆裝風(fēng)干土8 kg。氮肥施用量與實(shí)際大豆田生產(chǎn)施用量基本一致。試驗(yàn)施用尿素0、0.04、0.08、0.12 g/kg 4個(gè)處理，每個(gè)處理5次重復(fù)，共2×4×5=40盆。分別在苗期、開花期、結(jié)莢期、鼓粒期、成熟期的晴天上午進(jìn)行取樣。取樣方法是每個(gè)處理采取3株生長旺盛的大豆植株，放在標(biāo)記好幾號的密封袋中，然后放入加有冰塊的保溫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室，然后用剪刀把植株的葉片和根系剪下來，用電子天平分別稱量葉片0.5 g和根系0.5 g的樣品，置于10 mL的試管中，之后放入-20℃冰箱中貯存作為待測樣品。

1.3測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 硝酸還原酶活性測定參照張憲政[7]等方法并稍作改動，將事先稱量好的不同處理樣品放在50 mL的錐形瓶中，用注射器抽取0.1 mol·L-1磷酸緩沖液5 mL，0.2 mol·L-1硝酸鉀溶液5 mL，在加入10 mL的蒸餾水，用真空泵進(jìn)行抽氣放氣，反復(fù)進(jìn)行多次之后，把錐形瓶放入30℃溫箱中置于20 min，然后每個(gè)處理分別取2 mL反應(yīng)液，加入a-萘胺試劑2 mL，磺胺試劑4 mL，在30℃溫箱中反應(yīng)40 min，當(dāng)溶液冷卻之后，在540 nm波長下測定OD值，記錄數(shù)據(jù)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：用移液器吸取不同濃度梯度的NaNO2溶液1 mL置于試管中，加入a-萘胺試劑2 mL，磺胺試劑2 mL，左右搖晃10次，靜止30 min左右，在540 nm波長下測定OD值，讀取吸光度值，并記錄數(shù)據(jù)。然后以NaNO2溶液為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制吸光度—濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 根系活力的測定根系活力測定方法采取四氮唑法（TTC）。將稱量好的根系樣品放入20 mL的三角瓶中，加入10 mL的0.5 mol·L-1磷酸緩沖液和0.5%TTC溶液，反復(fù)搖晃三角瓶，使其混合均勻。然后將大豆根系侵入到溶液中，在35℃溫箱中放置2 h，溫箱要用黑布進(jìn)行遮蓋，然后加入0.5 mol mol·L-1硫酸溶液進(jìn)行終止反應(yīng)。

將反應(yīng)好的根系放入冷卻的研缽中，放入少許石英砂和2～3 mL乙酸乙酯溶液進(jìn)行研磨，將研磨好的溶液倒入10 mL的試管中，加入一定量的乙酸乙酯溶液，使其定容在10 mL。然后在480 nm波長下進(jìn)行比色，讀取OD值。以空白試驗(yàn)作參比對照，測出吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以計(jì)算出來TTC的還原量。根系活力計(jì)算公式為：根系活力=TTC的還原量（μg）/根重（g）/時(shí)間（h）。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用DPS7.05版本數(shù)據(jù)處理軟件及Excel數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1東農(nóng)48各生育期NR的活性變化分析

由表2可以看出，東農(nóng)48隨著處理量的不同，各生育期NR活性也有較大的變化。主要表現(xiàn)為隨著N素劑量的增加，NR活性也不斷增高，其中0.08 g/kg的施N量下，不同生育期的NR活性均達(dá)到最高。而在同一劑量下（如0.08 g/kg），不同時(shí)期的大豆NR活性也具有顯著性差異，營養(yǎng)生長時(shí)期NR活性不斷提高，在結(jié)莢期活性達(dá)到最高，為445.3 μg/g FW，進(jìn)入生殖生長期之后活性開始下降，到成熟期活性僅有9.56，兩者相差46.5倍。綜合結(jié)果表明，適當(dāng)施用氮肥，可以增加NR活性，不施用氮肥或過高施用氮肥都會抑制NR活性。

表2 東農(nóng)48各生育時(shí)期葉片硝酸還原酶活性比較Table 2 Comparison of NR activity in different growing stage of Dongnong 48 soybean（μg/g FW·h mean±SE）

2.2合豐45各生育期NR的活性變化分析

由表3可知，不同處理之間的合豐45葉片中的NR存在顯著性差異，在0.04 g/kg氮素水平下，各生育期的NR活性均為最高，從苗期到結(jié)莢期NR活性先是呈上升趨勢，在結(jié)莢期達(dá)到峰值，活性為498.62 μg/g FW，從鼓粒期開始下降，成熟期NR達(dá)到最低值，是7.56 μg/g FW，兩者相差65.87倍。而高劑量N素處理下，苗期的NR活性為整個(gè)生育期最高，分別為293.25 μg/g FW和331.73 μg/g FW，隨后的生長過程中NR活性開始降低，到成熟期葉片中NR較少，這可能因?yàn)楦邉┝縉素短暫誘導(dǎo)植株的NR活性提高。

綜合結(jié)果表明：合豐45以0.04 g/kg氮素處理后NR的活性最高，而東農(nóng)48則是以0.08 g/kg氮素處理后NR的活性最高，兩個(gè)品種NR最高的生育期均是在結(jié)莢期。

表3 合豐45各生育時(shí)期葉片硝酸還原酶活性比較Table 2 Comparison of NR activity in different growing stage of Hefeng 45 soybean（μg/g FW·h mean±SE）

2.3氮素對大豆東農(nóng)48根系活力的影響

在不同氮素水平處理后，東農(nóng)48各生育時(shí)期的根系活力呈顯著的不同，在4個(gè)處理中，以根系活力高低的順序依次為0.04 g/kg、0.08 g/kg、0.12 g/kg和對照CK，高劑量0.12 g/kg處理之后根系活力與對照基本沒有差異。各處理的根系活力均在苗期為最高，分別是123.4 μg·g-1、96.5 μg·g-1、94.2 μg·g-1、87.5 μg·g-1。此外的4個(gè)生育期的根系活力都是呈逐漸下降的趨勢，到成熟期達(dá)到最低。這可能因?yàn)槊缙趯Φ匚蛰^多，促進(jìn)了根系對養(yǎng)分和水分的吸收和利用，成熟期根系面臨衰竭，活力降低（見圖1）。

圖1 氮素水平對東農(nóng)48根系活力的影響Fig.1 Effect of different nitrogen level on root activity in Dongnong 48

圖2 氮素水平對合豐45根系活力的影響Fig.3 Effect of different nitrogen level on root activity in Hefeng 45

2.4氮素對大豆合豐45根系活力的影響

由圖2可以看出，不同劑量的氮素處理后，合豐45根系活力有明顯變化，在0.08 g/kg處理后，各時(shí)期根系活力為最高，分別是對照的1.78倍、1.84倍、1.93和2.9倍。0.12 g/kg劑量處理后，各生育期的根系活力與對照相比無顯著性差異。而不同生育期，根系活力變化不同，根系活力最高時(shí)期為苗期，此后幾個(gè)生育時(shí)期根系活力呈下降趨勢，成熟期根系活力達(dá)到最低。

3 討論

謝運(yùn)河等[8]研究認(rèn)為氮素對于大豆根瘤固氮能力和生長發(fā)育有顯著的影響。眾所周知，大豆根瘤具有固氮能力，但其依靠自身固氮還不能滿足生長發(fā)育的需要，所以適量施用氮肥能夠提高大豆產(chǎn)量[10,11]。目前國內(nèi)外對氮素對硝酸還原酶活性影響較多，主要集中在小麥、甜菜、大豆上面[12,13]。葛文婷[4]等在研究大豆NR和施氮關(guān)系研究中指出，營養(yǎng)生長期大豆體內(nèi)的NR活性較低，進(jìn)入生殖生長期之后，NR活性逐漸提高，在盛花期前后達(dá)到峰值。而大豆中的NR主要存在于葉片當(dāng)中，根部僅有少量的NR[14]。劉勝利等[15]認(rèn)為大豆生殖開始時(shí)期為花期，這個(gè)階段需要合成大量的氮化合物，NR活性在此時(shí)期也是最高的。

目前，國內(nèi)外有關(guān)氮素影響大豆根系活力研究很少，主要集中在光質(zhì)、干旱環(huán)境因子上面[16,17]。陳雄偉等[18]在對氮素對水葫蘆影響研究指出，不同氮濃度對水葫蘆根系影響有顯著差異，其中以3.5 mL/L氮水平生長最好，但濃度過高也會抑制水葫蘆根系活力和過氧化物酶活性。

本研究表明：不同生育期大豆品種NR活性存在明顯差異，其中結(jié)莢期的活性達(dá)到最高，其次為苗期，成熟期時(shí)大豆體內(nèi)的NR活性較少，這與前人研究基本一致。而在施用氮素劑量和大豆NR活性之間的關(guān)系方面，東農(nóng)48是在0.08 g/kg氮素水平下各時(shí)期的NR活性最高，合豐45是在0.04 g/kg劑量下為最好。根系活力高低直接影響植物對水分和養(yǎng)分的吸收和利用，本研究認(rèn)為，氮素對大豆品種各生育期根系活力影響不同，其中兩個(gè)品種均以苗期根系活力最高，可能是因?yàn)槊缙谔幱谏L的前期，對氮素吸收能力較強(qiáng)，利用率較高。本研究尋找出大豆生長的最佳施用氮素水平和明確NR活性最高的生育期，為今后大豆實(shí)際生產(chǎn)具有重要意義。但是有關(guān)NR和根系活力在苗期和開花期反應(yīng)的差異，其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步進(jìn)行研究。

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Effect of Nitrogen Level on Nitrate Reductase(NR)and Root Activity of Soybean

MA Gui-xiang,MEN Zhong-hua
Department of Biological Science and Technology,Baotou Teachers College,Baotou014030,China

In order to research the effect of different nitrogen level on soybean nitrate reductase and root activity by using pot experiments and lab analysis in soybean variety Dongnong48 and Hefeng45.The results showed that NR and root activity has obviously changed with two varieties at after different nitrogen treatment.The nitrate reductase and root activity in the leaves of soybean were different significantly at every stage,which NR and root activity were highly at pod-setting and seedling.Comprehensive analysis showed that appropriate nitrogen levels could be increased nitrate reductase and root activity for accumulation of photosynthate.

Nitrogen;soybean;nitrate reductase(NR);root activity

Q945.15

A

1000-2324(2014)05-0656-04

2013-01-23

2013-03-22

馬桂香(1983-),女,在讀研究生.研究方向:植物生理學(xué).E-mail:15849463829@163.com