許殊

重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)工程系,重慶408000

一種適合MSAP分析谷物干種子的DNA提取方法

許殊

重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)工程系,重慶408000

甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)是DNA甲基化的主要研究技術(shù)，獲得高質(zhì)量的DNA是MSAP分析的基礎(chǔ)。針對玉米Zea mays(L.)等干種子富含多糖、蛋白質(zhì)且與核酸結(jié)合緊密等特點，采用改良的CTAB-SDS法對其基因組總DNA進行提取，對DNA進行質(zhì)量檢測，使用限制性內(nèi)切酶EoRI和HpaII酶切，進行MSAP分析。結(jié)果表明，改良CTAB法可從玉米等干種子中獲得純度高、完整性好的總DNA，其OD260 nm/OD280 nm處于1.86，OD260 nm/OD230大于2.00，產(chǎn)率達1.8 μg/mg，多糖、蛋白質(zhì)和RNA等雜質(zhì)被去除干凈，無降解現(xiàn)象，所提取的DNA可被等限制性內(nèi)切酶完全雙酶切，進行MSAP分析得到大量清晰穩(wěn)定的多態(tài)性條帶。結(jié)果表明改進的CTAB-SDS法更適合于干玉米種子高質(zhì)量總DNA的提取。

玉米種子;胚;DNA提取;MSAP

谷物干種子中含有大量的多糖和蛋白質(zhì)，目前從谷物干種子中提取高質(zhì)量的基因組DNA對于多數(shù)基因組實驗分析成為一個瓶頸。例如，甲基化敏感擴增多態(tài)性（MSAP）技術(shù)已成為一個越來越受歡迎的用來識別一系列已知序列的基因的反向遺傳學(xué)研究工具，MSAP技術(shù)是分析影響種子活力因素的最有效的方法之一[1,2]。由于干種子中多糖等物質(zhì)和核酸具有相似的物理和化學(xué)性質(zhì)，而蛋白質(zhì)與核酸緊密結(jié)合形成復(fù)合物，基于種子幼胚基因組DNA進行高質(zhì)量的提取具有一定的難度，為降低實驗難度，大多數(shù)實驗采用葉片基因組DNA[3]。因此，提取解決該問題關(guān)鍵則是有效去除與核酸緊密結(jié)合的多糖和蛋白質(zhì)。目前為止，大量的實驗方法見諸報端，例如CTAB法、SDS法和高低鹽PH值法等已成為最常用的提取植物基因組DNA的方法[4]。另外，一些商業(yè)試劑盒也被推廣使用。但是這些方法對于干燥的谷物種子樣品存在或多或少的缺點。CTAB法能夠有效去除多糖，SDS法則能夠有效去除蛋白質(zhì)，這兩個方法的優(yōu)勢則為對方的缺點，單獨使用均不能有效解決從谷物干種子中提取高質(zhì)量的基因組DNA的問題。

為了從干種子中獲得高質(zhì)量的基因組DNA，我們結(jié)合傳統(tǒng)的CTAB法和SDS法，采取二次沉淀的策略從干種子中獲得DNA，從而避免了商業(yè)試劑盒在提取高質(zhì)量DNA中所付出的昂貴代價，并且該方法不需要過濾和吸附裝置。本實驗在原有方法的基礎(chǔ)上進行改良與比較，找到了一種能夠從玉米種子胚中獲得高質(zhì)量DNA的方法，以期順利開展MSAP分析等相關(guān)分子生物學(xué)實驗。

1 材料與方法

1.1實驗材料

實驗中使用的鄭單958種子購買于中國種子集團。其他谷物種子（大麥、小麥、水稻和高粱）均收集于農(nóng)場試驗田，干燥器室溫儲藏備用。

大約100 mg的成熟胚從干種子中剝離，分別用于提取基因組DNA?；蚪MDNA的產(chǎn)率用μg/mg(DNA/干樣)表示。

1.2實驗試劑及方法

1.2.1 實驗試劑CTAB裂解液：3%CTBA；4%PVP；100 mMTris-HCl；20 mM EDTA（pH 8.0）；1.4 M的NaCl。

SDS溶液：4%SDS；4%PVP；100 mMTris-HCl；20 mM EDTA（pH 8.0）；1.4 M的NaCl。70%酒精；無水乙醇；平衡酚:氯仿:異戊醇=25:24:1（體積比）；10 mg/mL RNase；ddH2O。

1.2.2 DNA提取方法取100 mg鄭單958種胚，放置于-20℃冰箱保存，然后分別按以下方法進行DNA提取和純化：

1.2.2.1 改良CTAB-SDS法1.將冷凍干燥的樣品用液氮研磨成粉，轉(zhuǎn)移到離心管，加入65℃預(yù)熱的2 mL CTAB抽提液，65℃保溫30 min，間或輕搖混勻。12000 r/min室溫離心10 min，取上清液；2.加入1/5體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），輕輕混勻2 min，12000 r/min室溫離心10 min，取上清液；3.加入等體積的-20℃預(yù)冷的異戊醇，輕輕搖動10 min，顛倒混勻至有白色絮狀沉淀出現(xiàn)，然后在4℃條件下12000 r/min離心10 min，沉淀出DNA，去除上清液；4.向沉淀中加入2 mLSDS提取液，65℃保溫30 min，直至沉淀不再溶解，12000 r/min室溫離心10 min，取上清液；5.重復(fù)步驟2；6.加入等體積的-20℃預(yù)冷的異戊醇，輕輕搖動2 min，顛倒混勻，放入-20℃冰箱中30 min，4℃條件下12000 r/min離心10 min，沉淀出DNA，去除上清液；7.用70%乙醇洗滌2次，每次12000 r/min離心5 min。棄乙醇，自然晾干；加入50 μL去離子水，輕輕敲打使沉淀溶解；8.加入3 μL10 mg/mL Rnase 37℃水浴，保溫1 h，去除RNA，DNA提取物于-20℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 CTAB法參照Joseph等人的方法[5]。

1.2.2.3 SDS法參照Stephen.L等人的方法[6]。

1.2.2.4 高低鹽pH法參照Pierre G等人的方法[7]。

圖1 CTAB-SDS法提取DNA操作流程圖Fig.1 The operation process of DNAextracted with CTAB-SDS method

1.3DNA質(zhì)量檢測

采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整度，使用Nanodrop(NP-2000)分光光度計檢測DNA純度及濃度。

1.4DNA的MSAP分析

MSAP分析參照Meng[8]的方法?；蚪MDNA分別使用限制性內(nèi)切酶EcoRI/HpaII和EcoRI/MspI(TaKaRa，大連，中國)進行酶切。酶切-連接體系25 μL，包括模版DNA 250 ng，3 U EcoR I,3 U Hpa II(or Msp I)，HpaII/MspI接頭2 μL（5 μg/mL），EcoRⅠ接頭0.2 μL（5 μg/mL），T4連接酶1.5 U，2.5μL 10×T4連接酶緩沖液。體系混勻37℃過夜，然后65℃孵育10 min。酶切、連接產(chǎn)物用于預(yù)擴增。

預(yù)擴增體系25 μL，包括5 μL的酶切-連接產(chǎn)物，40 ng的E+1和HM+1預(yù)擴增引物(表1)，1 U的Taq DNA聚合酶1.0 μL的dNTPs(2 mmol/L)，1.2 μL的MgCl2(2.5 mmol/L)，和2 μL的10×PCR buffer。預(yù)擴增反應(yīng)程序為94℃1 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋20倍用于選擇性擴增。選擇性擴增體系25 μL，包括EcoRI和HpaII/MspI選擇性擴增引物各2 μL（10 mmol/L）、2.5 μL的PCR緩沖液，Taq DNA聚合酶1 U、dNTP 1.6 μL（2 mmol/L）、稀釋20倍的預(yù)擴增產(chǎn)物5 μL。選擇性擴增反應(yīng)程序為94℃1 min；94℃30 s，65℃30 s，72℃1 min，退火溫度每循環(huán)一次降低0.7℃，13個循環(huán)；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，23個循環(huán)；72℃延伸10 min。

預(yù)擴增產(chǎn)物與變性緩沖液1:1混合，95℃變性1 min，產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳預(yù)檢測，6%的變性聚丙烯酰胺凝膠和銀染法進行分離和檢測。

表1 MSAP引物和接頭序列Table 1 The sequence of joint and MSAP primer

2 結(jié)果與分析

提取基因組DNA的過程中所示流程圖如圖1所示。為了優(yōu)化實驗步驟，達到高質(zhì)量、高產(chǎn)出，使用已報道過的三種方法分別進行了玉米種胚DNA的提取。如圖2所示，傳統(tǒng)的CTAB法和SDS法有相同的效果，在點樣孔中均存在一定的蛋白質(zhì)，高低鹽PH值法提取的DNA完整性明顯略低于前三者。而CTAB-SDS方法提取的DNA不含蛋白質(zhì)，且完整性要高于高低鹽pH值法。從表2可知，CTAB-SDS法提取的DNA產(chǎn)率略次于傳統(tǒng)的CTAB法和SDS法，而高于高低鹽pH值法。從OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm上可以看出CTAB-SDS法均高于其他三種方法，其中OD260 nm/OD280 nm處于1.80～2.00時，表示DNA樣品蛋白質(zhì)含量較低，DNA的純度最高；OD260 nm/OD230 nm大于1.90時，說明DNA樣品無有機小分子等雜質(zhì)污染。由此可知，改良的CTAB-SDS法在玉米干種子高質(zhì)量DNA提取方面優(yōu)于其他三種方法。

圖2 不同DNA提取方法電泳圖Fig.2 Electrophoresis of different DNA extraction

表2 玉米干種子種胚提取DNA的四種方法比較Table 2 Comparison between 4 methods DNA extracted from the embryo of maize dry seed

為了檢驗CTAB-SDS法是否適用于其他谷物干種子，我們挑選了小麥、大麥、水稻、玉米、和高粱5種谷物干種子進行DNA提取比較。從圖3可以看到，除了條帶亮度不一致之外，5種作物的DNA條帶較為一致，且泳道內(nèi)無彌散相信，表明DNA完整性較高。最上端的點樣孔內(nèi)無白色影像，表明各點樣孔內(nèi)均不存在蛋白質(zhì)，100 bp以下區(qū)域不存在拖帶現(xiàn)象，說明DNA樣品不存在雜質(zhì)污染。從表3可知，5種不同的谷物干種子提取DNA的產(chǎn)率均高于1 μg，且OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm值均處于合格范圍之內(nèi)，表明該方法適用于多種谷物干種子高質(zhì)量DNA的提取。

圖3 5種谷類作物種子DNA提取效果Fig.3 Effect of DNAextracted from 5 kinds of cereal crops

表3 5種作物使用CTAB-SDS法提取DNA質(zhì)量比較Table 3 Comparison of DNAquality extracted with CTAB-SDS method from 5 kinds of crops

DNA質(zhì)量的好壞決定著下游實驗的順利與否，通過MSAP分析，CTAB-SDS法提取的高質(zhì)量DNA能夠被限制性內(nèi)切酶完全酶切，通過預(yù)擴增和選擇性擴增，實現(xiàn)甲基化敏感多態(tài)性條帶的分離。圖4為DNA雙酶切效果，與正向?qū)φ誅NA相比較，酶切DNA泳道內(nèi)呈現(xiàn)出彌散狀，DNA的條帶已經(jīng)消失，表明DNA已經(jīng)被完全酶切。MSAP聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠順利完成，實現(xiàn)多態(tài)性片段分離，可以繼續(xù)完成后續(xù)實驗。表明使用該法提取的DNA能夠勝任MSAP等對DNA質(zhì)量要求較高的實驗。

圖4 DNA雙酶切效果Fig.4 The effect of DNAcut with enzyme

圖5 選擇性擴增敏感多態(tài)性條帶Fig.5 Sensitive polymorphism bands by selective amplification

3 討論

DNA提取種子分子生物學(xué)研究的最基礎(chǔ)和最關(guān)鍵步驟的步驟之一，種子處于干燥狀態(tài)時，由于DNA與組織蛋白等緊密結(jié)合形成復(fù)合物，在提取高質(zhì)量DNA方面具有一定的難度，而當(dāng)種子含有大量的蛋白質(zhì)、多糖和次生代謝產(chǎn)物時則又加大了難度。和其他的生物分子一樣，如酚類、丹寧酸、色素等，多糖和蛋白質(zhì)干擾一些生物酶的活性，比如DNA聚合酶、連接酶和限制性內(nèi)切酶等[9]。因此，這些復(fù)合物被認為是影響DNA消化的污染物，干擾后續(xù)實驗的進行。比如本實驗用到的玉米干種子就是這樣的一種實驗材料，其提取高質(zhì)量DNA就顯得較為困難。

聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是一種能與多酚形成不溶物的絡(luò)合物，可以降低DNA的酚類物質(zhì)污染，此外，PVP還能夠與多糖形成復(fù)合物并將其移除[10]。因此，PVP被應(yīng)用于CTAB提取DNA的步驟中。本實驗中，增加了PVP的濃度，起到了提高提取效率的作用。使用SDS裂解液可以有效地裂解細胞并釋放出基因組DNA，但是由于多糖和蛋白質(zhì)隨著核酸一起沉淀，則使獲得高質(zhì)量DNA成為了難題。用于沉淀的蛋白質(zhì)在SDS溶液中是不溶解的，而DNA則可以溶解，因此增加SDS二次溶解蛋白質(zhì)和核酸復(fù)合物便成為了從干種子中獲取高質(zhì)量DNA的關(guān)鍵步驟。

近年來，基于不同的原理和幾種改良的DNA提取方法，越來越多的植物DNA提取試劑盒被報道，但是，大多數(shù)試劑盒仍只是適用于新鮮的植物組織。但有時樣品收集于特殊時期，植物材料處于干燥和半干燥狀態(tài)，因此這些方法就很難完成從這些組織材料中提取高質(zhì)量DNA的任務(wù)。另外，對于很多實驗室而言，實驗中所使用的試劑盒對于日常的DNA提取顯得較為昂貴。種子分子生物學(xué)研究的熱點之一是分子機理研究，然而對于干種子建立一種低廉且高效的DNA提取方法是很必要的。本實驗中以成熟的玉米干種子進行高質(zhì)量DNA的提取和后續(xù)的酶切、MSAP等實驗表明，我們預(yù)期該方法能夠適用于其他物種的高質(zhì)量DNA的提取。

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An Efficient DNA Extraction Method for MSAP Analysis on the Dry Cereal Seeds

XU Shu
Chongqing Industry&Trade Polytechnic College,Chongqing408000,China

Methylation sensitive amplification polymorphism(MSAP)is the main technology of DNA methylation and to obtain high quality DNA is the basis of the MSAP analysis.The dry embyos ofZea may(L.)seeds are rich in polysaccharides, protein and closely bind to nucleic acid preventing DNA extraction.The genomic DNA of maize seed was extracted by improved CTAB-SDS method and DNA quantity was checked.DNA samples were digested by restriction enzymesEcoR I andHpaII and MSAP analysis.The results showed that the genomic DNA was pure and integral without polysaccharides, protein,RNA and degradation.A260/A280of the obtained DNA solution was 1.86 and A260/A230ratios was greater than 2.00. The production rate was 1.8 μg/mg.The total DNA can be digested completely and MSAP fragments amplified with DNA template showed clear hands,and good polymorphic,stability and repetition.The results showed that the improved CTAB-SDS method was more suitable for high quality DNAextraction from dry corn seed.

Maize seed;embryo;DNAextraction;Methylation SensitiveAmplification Polymorphism(MSAP)

Q781

A

1000-2324(2014)05-0660-05

2013-03-11

2013-03-23

許殊(1973-),男,漢族,重慶墊江人,本科,高級講師,研究方向:植物及植物生理.