馬鵬生

寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川750000

豬殃殃抗雙氟磺草胺的生理機(jī)制研究

馬鵬生

寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川750000

本文通過田間試驗(yàn)和室內(nèi)分析測(cè)定，對(duì)敏感性豬殃殃（S生物型）和抗性豬殃殃（R生物型）生理指標(biāo)變化進(jìn)行了初步研究。試驗(yàn)結(jié)果表明：在田間推薦用量上限4.5 g a.i·hm-2雙氟磺草胺處理后，R生物型體內(nèi)的ALS活力表現(xiàn)為先降低后增高趨勢(shì)，第7 d時(shí)達(dá)到峰值，是對(duì)照的1.4倍。而S生物型體內(nèi)ALS活力隨著處理時(shí)間延長也逐漸降低。通過對(duì)保護(hù)性酶POD、SOD研究結(jié)果表明，R生物型噴藥后，體內(nèi)的POD變化呈增高-降低-增高的趨勢(shì)，第7 d時(shí)達(dá)到峰值，比對(duì)照高16.5 g-1·FW-1，SOD變化趨勢(shì)則表現(xiàn)為先降低后增高。S生物型在處理后第4 d，體內(nèi)的POD活性顯著下降，7 d時(shí)降到最低，而SOD變化則為隨著處理時(shí)間延長，SOD活性也逐漸降低。綜合分析表明，R生物型在受到雙氟磺草胺脅迫后，植株能夠進(jìn)行正常生長，靶標(biāo)酶ALS仍然保持較高的活性，保護(hù)性酶POD、SOD持續(xù)穩(wěn)定是對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生抗性的主要生理機(jī)制。

豬殃殃;雙氟磺草胺;ALS活性;保護(hù)性酶

豬殃殃（Galium aparine L.）屬茜草科一年生或越年生雜草，攀援或蔓生，是黃河以南各省冬小麥、冬油菜田中最重要的惡性雜草之一。雙氟磺草胺是美國陶氏益農(nóng)公司在20世紀(jì)90年代中期開發(fā)的三唑嘧啶磺酰胺類除草劑，主要用來防治麥田豬殃殃、野油菜、繁縷、播娘蒿、薺菜等闊葉雜草。其作用機(jī)理是通過抑制植物中特有的乙酰乳酸合成酶(ALS)從而阻礙植物細(xì)胞的分裂與伸長，抑制支鏈氨基酸的生物合成途徑，阻斷細(xì)胞分裂過程中從G2到M階段，以及GI到S過渡，達(dá)到殺死雜草的目的[1]。近年來根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，麥田豬殃殃已經(jīng)對(duì)抑制ALS位點(diǎn)的除草劑產(chǎn)生一定的抗藥性[2]。彭學(xué)崗等[3]在研究豬殃殃抗性過程中發(fā)現(xiàn)，北方不同省份豬殃殃對(duì)苯磺隆的抗藥性有很大的差異。其中抗性程度最高為河南省，抗性倍數(shù)達(dá)到4.3倍。毛海燕等[4]在生產(chǎn)實(shí)踐過程中也發(fā)現(xiàn)苯磺隆對(duì)豬殃殃的防效明顯下降的現(xiàn)象，但這些研究都僅僅局限于對(duì)磺酰脲類除草劑的抗性上面。有關(guān)豬殃殃對(duì)磺酰胺類除草劑的抗性問題至今國內(nèi)還未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過測(cè)定雙氟磺草胺處理后的R生物型和S生物型體內(nèi)靶標(biāo)酶ALS、主要保護(hù)性酶SOD、POD的變化情況，明確其對(duì)雙氟磺草胺的抗性程度及抗性產(chǎn)生的生理機(jī)制，以其為今后如何治理抗性豬殃殃奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1供試材料

1.1.1 供試試劑試驗(yàn)除草劑為5%雙氟磺草胺懸浮劑，由美國陶氏益農(nóng)（中國）有限公司生產(chǎn)。本試驗(yàn)所用的化學(xué)及生化試劑見（下表1）。

表1 化學(xué)及生化試劑Table1 Chemicals and Biochemicals

1.1.2 供試儀器本試驗(yàn)使用的儀器有恒溫水浴振蕩器，由金壇市金南儀器制造有限公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機(jī)(2～16 p)，由德國Sigma公司生產(chǎn)；UV-2201型紫外分光光度計(jì)，由上海譜元儀器有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 供試材料本試驗(yàn)的豬殃殃均采自于河南省駐馬店市麥田。

1.2測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 ALS活性測(cè)定

1.2.1.1 溶液配制方法

磷酸緩沖液：配制50 mmol·L-1K2HPO4-KH2PO4PH=7.0的緩沖溶液；酶提取液：配制含0.5 mmol·L-1MgCl2，0.5 mmol·L-1TPP，1 mmol·L-1丙酮酸鈉PH7.0的磷酸緩沖液；酶溶解液：配制含0.5 mmol·L-1MgCl2的0.1 mol·L-1，20 mmol·L-1丙酮酸鈉pH 7.0的磷酸緩沖液。

1.2.1.2 ALS提取方法

參照Fan等[5]方法并稍作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱量0.5 g的豬殃殃葉片剪碎后立即放入預(yù)冷的研缽中，加入少許液氮，5 mL酶液及石英砂，在冰浴上進(jìn)行持續(xù)研磨，當(dāng)葉片成于勻漿時(shí)，倒入事先準(zhǔn)備好的離心管中，定容至8 mL，于25000 g 4℃下離心30 min，用移液槍將上清液置于新的試管中，加入(NH4)2SO4晶體，使之飽和度達(dá)到50%左右，當(dāng)溶液沉淀2 h后，于25000 g 4℃下離心20 min，把上清液倒掉，加入8 mL酶溶解液中待測(cè)。

1.2.1.3 ALS活性測(cè)定方法

首先在10 mL的玻璃試管中加入1 mL酶液，0.1 mL磷酸緩沖液及0.8 mL酶反應(yīng)液，搖勻后在32℃的恒溫水浴鍋中進(jìn)行1 h的暗反應(yīng)，之后加入0.2 mL 3 mol/L H2SO4讓其中止反應(yīng)，在60℃水浴鍋中脫羧10 min，在加入1 mL 5%甲萘酚和1 mL0.5%肌酸顯色20 min，隨后立即轉(zhuǎn)入到冰浴中冷卻1 min，在525 nm波長下進(jìn)行比色。

1.2.2 過氧化物酶POD活性測(cè)定

1.2.2.1 酶液配制與提取

參照李合生等[6]方法并稍作改動(dòng)，酶提取液配制：配置0.05 mol·L-1愈創(chuàng)木酚溶液；0.05 mol·L-1、pH 5.5的磷酸緩沖液。

酶液的提?。簻?zhǔn)確稱取0.5 g材料，剪碎后放入液氮預(yù)冷的研缽中，加入3 mL的磷酸緩沖液進(jìn)行持續(xù)研磨，當(dāng)狀態(tài)為勻漿時(shí)，將其倒入離心管中。放置4℃條件下，提取1 d，然后于25000 g 4℃下離心20 min

取上清夜即為酶提取液。

1.2.2.2 POD酶活性的測(cè)定

POD酶活性測(cè)定的反應(yīng)體系包括：1.0 mL 2%H2O2；1.0 mL 0.05 mol·L-1愈創(chuàng)木酚溶液；2.9 mL 0.05 mol·L-1、pH 5.5的磷酸緩沖液，0.2 mL酶液，反應(yīng)體系加入上述酶液之后，在水浴35℃保溫3～5 min，在470 nm波長下進(jìn)行比色，每隔1 min測(cè)定1次，記錄吸光度值，酶活性單位(u)以每min內(nèi)A470變化0.01為一個(gè)。

1.2.3 抗氧化酶SOD活性測(cè)定

1.2.3.1 酶液提取

參照趙世杰等[7]方法并稍作改動(dòng)，將待測(cè)0.5 g材料切碎之后，放入研缽中，加入1 mL提取液和少許石英砂，在冰浴下快速研磨，當(dāng)成漿時(shí)，倒入離心管中，加入4～5 mL提取液，于15000 g，4℃下進(jìn)行離心15 min，取上清夜為SOD粗提液。

1.2.3.2 SOD酶活性測(cè)定反應(yīng)體系

表2 SOD酶活性測(cè)定的反應(yīng)體系Table 2 SOD activity assay of reaction system

1.2.3.3 SOD活性的測(cè)定和計(jì)算

反應(yīng)的步驟如下，首先將空白試管用黑紙包起來，其他反應(yīng)的試管放置于日光燈15000 LX下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為15 min左右。然后以空白試管作為對(duì)照，在波長560 nm下，分別測(cè)定其他各管的消光度值，SOD活性單位用抑制NBT光化還原的50%作為一個(gè)酶活性單位來表示。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用EXCEL 2003和DPS 3.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果用3次重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1ALS活性分析

由圖1可以看出，在田間推薦劑量上限4.5 g a.i·hm-2處理后，R生物型和S生物型體內(nèi)的ALS活力變化有明顯差異，S生物型經(jīng)過處理之后ALS活力呈顯著降低趨勢(shì)并均低于對(duì)照。到第7 d時(shí)，比對(duì)照降低29 nmol/mg，比R生物型降低45.1 nmol/mg，這表明S生物型體內(nèi)的ALS酶受到藥劑抑制作用，使合成支鏈氨基酸的能力下降，從而對(duì)植株造成毒害作用。而R生物型噴藥后，ALS活力呈先降低后增高趨勢(shì)，ALS活力前期受到了短暫的抑制，但抑制作用很快解除，以后一直高于對(duì)照。在第7 d時(shí)，體內(nèi)ALS活性達(dá)到峰值，是對(duì)照的1.4倍(見圖1)。因此，R生物型在處理后體內(nèi)靶標(biāo)酶仍然保持較高的活性，是對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生耐性的主要原因之一。

2.2雙氟磺草胺對(duì)豬殃殃P(guān)OD活性的影響

過氧化物酶POD主要的作用是清除植物體內(nèi)的H2O[8]。在田間推薦上限劑量4.5 g a.i·hm-2處理后，R生物型和S生物型體內(nèi)的POD活性均表現(xiàn)為先增高后降低趨勢(shì)（見圖2），并且前3 d都高于對(duì)照。第4 d時(shí)，R生物型和S生物型POD活性出現(xiàn)兩極分化，R生物型不斷增高，7 d時(shí)達(dá)到峰值，比對(duì)照高16.5 g-1·FW-1。S生物型則不斷降低，7 d時(shí)降到最低，比對(duì)照低16 g-1·FW-1，比R生物型低32.5 g-1·FW-1。這表明雙氟磺草胺脅迫后，S生物型體內(nèi)的POD活性逐漸下降，從而降低了清除H2O2的能力，使脂質(zhì)受到嚴(yán)重的損害，吸水性急劇下降導(dǎo)致植物枯死。然而R生物型體內(nèi)的POD活性增加，及時(shí)清除H2O2，使植物健康生長。

圖1 雙氟磺草胺對(duì)豬殃殃ALS活力的影響Fig.1 Effect of florasulam on ALS activity of Galium aparine L.

圖2 雙氟磺草胺對(duì)豬殃殃P(guān)OD活性的影響Fig.2 Effect of florasulam on POD activity after spraying Galium aparine L.

2.3雙氟磺草胺對(duì)豬殃殃SOD活性的影響

在劑量為4.5 g a.i·hm-2處理后，R生物型和S生物型體內(nèi)的SOD活性差異明顯（見圖3）。S生物型在噴藥后，隨著處理時(shí)間延長，SOD活性也逐漸降低，到第7 d時(shí)達(dá)到最低，比R生物型低290.7 U·g-1·FW-1，比CK低309.5 U·g-1·FW-1。而R生物型SOD活性在噴施雙氟磺草胺后，前3 d表現(xiàn)為降低趨勢(shì)，從第4 d開始增高，到6 d時(shí)基本恢復(fù)到同期對(duì)照水平。這表明R生物型在脅迫后，體內(nèi)的SOD活性逐漸增加，解除了超氧自由基的毒害作用，這可能是對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生抗性的另一個(gè)原因。

圖3 雙氟磺草胺對(duì)豬殃殃SOD活性的影響Fig.3 Effect of florasulam on SOD activity of Galium aparine L.

3 討論

通過上述研究表明，河南駐馬店地區(qū)麥田豬殃殃已經(jīng)對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生了一定的抗性，即使田間推薦上限用量也不能達(dá)到很好的防效，而有調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，雙氟磺草胺已經(jīng)在該地區(qū)連續(xù)單一用藥10余年之久，長期單一用藥增加了對(duì)豬殃殃的選擇壓力，從而產(chǎn)生抗性單體，并逐漸形成抗性種群[9,10]。

通過對(duì)性豬殃殃生理指標(biāo)研究中發(fā)現(xiàn)，在雙氟磺草胺脅迫下，R生物型和S生物型體內(nèi)的ALS活力變化明顯，S生物型ALS活力隨著時(shí)間延長呈顯著性降低趨勢(shì)，這表明ALS活力酶受到抑制，使之合成支鏈氨基酸的能力降低，造成蛋白質(zhì)合成紊亂而死亡[11]，這與隋標(biāo)峰等[12]研究麥田抗性雜草在苯磺隆處理后，乙酰乳酸合成酶的活性一直增加的結(jié)果是一致的。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道ALS基因突變或過量表達(dá)是雜草對(duì)除草劑敏感性降低的主要分子機(jī)制[13]。關(guān)于本文所研究的R型豬殃殃抗性分子機(jī)制需要在今后通過分子檢測(cè)手段來確定。

從生理指標(biāo)POD、SOD酶的活性研究發(fā)現(xiàn)，在雙氟磺草胺脅迫下，S生物型體內(nèi)的保護(hù)酶POD、SOD活性不斷降低，然而R生物型體內(nèi)的POD活性則高于對(duì)照，SOD活性變化與對(duì)照基本無差異。這表明POD活性隨著處理時(shí)間延長而不斷上升，可能是為了維持自身的代謝，而對(duì)雙氟磺草胺產(chǎn)生的一種保護(hù)機(jī)制[14,15]。另外，本文僅研究了豬殃殃在受到雙氟磺草胺脅迫后，植物體內(nèi)的靶標(biāo)酶ALS、超氧化物歧化酶SOD、過氧化清酶POD的變化情況，沒有對(duì)解毒代謝酶GSTs、P450的變化進(jìn)行深入分析，也沒有涉及到豬殃殃對(duì)雙氟磺草胺的吸收傳導(dǎo)，需要在未來做更進(jìn)一步研究。

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Study on the Physiological Mechanism of the Resistance of Galium aparine L.against Florasulam

MA Peng-sheng
School of Agriculture Ningxia University,Yinchuan,750000,China

This paper preliminarily studied the physiological symptom change of sensitiveGalium aparineL.(S biotype)and resistantGalium aparineL.(R biotype)through field test and analysis measure in laboratory.The results showed that:the ALS dynamic performance in R biological increased first then decreased after sulfur difluoride alachlor treatment in the field recommended dosage limit 4.5 g a.i hm-2,and reached a peak at 7 d,which is 1.4 times of references.While in S biological, the ALS dynamic performance gradually reduce with the prolong of processing time.Results through the study on protective enzyme POD and SOD showed that POD changes in R biotype after spraying was increasing,reducing and increasing and reach a peak at 7 d,which is 16.5 g-1·FW-1higher than the reference.SOD changing trend was decreasing first then increasing.S biotype at 4 d after processed.POD activity in the body was significantly decreased after treatment and reached a minimum at 7 d.SOD changes prolonged with the prolonging processing time and SOD activity was also decreased. Comprehensive analysis showed that the plants of R bio-type can normally grow after being stressed by double fluoride sulfur alachlor and neuropathy target esterase ALS remained high activity,the sustained and steady protective enzymes POD, SOD was the main physiological mechanism producing anti-sulfonamide to Florasulam.

Galium aparineL.;Florasulam;ALS activity;protective enzymes

TQ450.1+3

A

1000-2324(2014)05-0778-04

2013-04-20

2013-05-12

馬鵬生(1979-),男,漢族,甘肅省靜寧縣人,講師,研究方向:天然藥物藥理學(xué)