牟龍妹，劉宜子，李佳楠

（江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系，湖北武漢430056）

菜豆植物凝集素對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響

牟龍妹，劉宜子，李佳楠*

（江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系，湖北武漢430056）

目的分析不同品種菜豆植物凝集素對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響，明確其生物安全性。方法小鼠腹腔注射3個(gè)品種菜豆凝集素，6 d后取小鼠骨髓細(xì)胞，吉姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠骨髓細(xì)胞的微核發(fā)生情況并進(jìn)行微核發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)，進(jìn)而判斷不同種類菜豆植物凝集素是否具有致突變作用。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組3個(gè)品種的菜豆植物凝集素引起的小鼠微核發(fā)生率與陰性對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率與菜豆植物凝集素呈劑量—反應(yīng)關(guān)系，但與小鼠性別無(wú)關(guān)。結(jié)論3個(gè)含量分別為高、中、低水平的菜豆植物凝集素對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞均無(wú)致突變作用，可進(jìn)一步用于有關(guān)藥物和生物制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

菜豆；植物凝集素；微核試驗(yàn)；致突變作用

凝集素是能夠識(shí)別和結(jié)合微生物或昆蟲(chóng)及哺乳動(dòng)物消化道中的糖復(fù)合物的植物蛋白［1］，具有只對(duì)某一種特異性糖基專一性結(jié)合的特點(diǎn)［2］，且具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合而不影響其生物活性，可用于免疫細(xì)胞化學(xué)的研究［3-4］。微核試驗(yàn)是檢測(cè)染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗(yàn)方法，最常用的是嚙齒類動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞（polychromatic erythro?cyte，PCE）微核試驗(yàn)。如果與對(duì)照組比較，處理組PCE微核率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加，并有劑量—反應(yīng)關(guān)系，則可認(rèn)為該受試物是哺乳動(dòng)物體細(xì)胞的致突變物［5-6］。用微核試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)藥物、放射線、有毒物質(zhì)等對(duì)人體細(xì)胞或體外培養(yǎng)細(xì)胞遺傳學(xué)損傷是一個(gè)有效可行的方法，在遺傳毒理、醫(yī)學(xué)、食品、藥物、環(huán)境等諸多方面得到了廣泛的應(yīng)用。

在前期研究中，筆者已經(jīng)對(duì)56個(gè)品種的菜豆植物凝集素進(jìn)行了活性濃度測(cè)定，并成功分離純化到菜豆植物凝集素，本研究擬通過(guò)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)對(duì)已分離的菜豆植物凝集素進(jìn)行檢測(cè)，判斷其是否具有致突變作用，為菜豆植物凝集素的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

昆明小鼠40只，體重（20±2）g，來(lái)自江漢大學(xué)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在18～25℃。自由采食、飲水。

1.2 鮮材與試劑

菜豆鮮莢由江漢大學(xué)湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)基地提供。本實(shí)驗(yàn)樣品均為2014年春季栽植。本實(shí)驗(yàn)選取菜豆開(kāi)花后15 d的成熟商品莢作為研究對(duì)象，共計(jì)3個(gè)品種（見(jiàn)圖1）。硫酸銨、甘油、甲醇、吉姆氏（Giemsa）色素、環(huán)磷酰胺（CP）、丙三醇、磷酸緩沖液、帶油鏡鏡頭顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)板。

圖1 供試菜豆品種及其凝集素含量Fig.1Kidney bean varieties and lectin content

1.3 方法

1.3.1 菜豆植物凝集素的制備將新鮮菜豆豆莢打碎成漿后，稱取勻漿10 g，加入PBS溶液定容至10 mL；4℃搖床振蕩浸提24 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液15 mL，加入硫酸銨晶體至40%飽和度，置4℃冰箱過(guò)夜；將過(guò)夜后的抽提液8 000 r/min離心20 min，再次收集上清；上清液內(nèi)再次加入硫酸銨晶體至70%飽和度和100%飽和度，置4℃冰箱過(guò)夜，8 000 r/min離心20 min，收集沉淀；將沉淀溶解于10 mL生理鹽水，4℃透析48 h，分裝后-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 微核檢測(cè)昆明小鼠40只，隨機(jī)分5組，每組8只，雌雄各半。Ⅰ組為陰性對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別腹腔注射不同品種的菜豆植物凝集素（Ⅱ組：春秋無(wú)架四季豆；Ⅲ組：九粒白架豆王；Ⅳ組：Bean Saint esprit a oeil rouge），Ⅴ組為陽(yáng)性對(duì)照組，腹腔注射環(huán)磷酰胺（CP）20 mg/kg，連續(xù)注射6 d后間隔24 h取材。

引頸法處死小鼠，取股骨骨髓細(xì)胞涂片，置于超凈工作臺(tái)自然干燥后置于甲醇中固定8～10 min；將固定好的涂片放入Giemsa液中染色20～30 min，立即用pH=6.8的磷酸緩沖液沖洗，置于超凈工作臺(tái)中風(fēng)干。每張涂片計(jì)數(shù)3 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE），采用雙盲法閱片計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)微核發(fā)生率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用方差分析進(jìn)行組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組雌鼠與雄鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率分別為（0.499±0.192）‰和（0.833±0.500）‰，為正常微核發(fā)生率范圍；實(shí)驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ雌鼠與雄鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率都較陰性對(duì)照組高，且菜豆植物凝集素含量與微核發(fā)生率呈劑量—反應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明菜豆植物凝集素對(duì)小鼠骨髓微核發(fā)生率具有一定影響；陽(yáng)性對(duì)照組雌鼠與雄鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率分別為（7.999±0.544）‰和（8.333± 0.235）‰，顯著高于實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組。

表13 個(gè)品種菜豆植物凝集素對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響Tab.1 Micronucleus ratio of mice bone marrow cells by 3 kinds of kidney bean lectin

從圖2可見(jiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組雌鼠與雄鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ微核發(fā)生率較陰性對(duì)照組高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雄性小鼠與雌性小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明性別對(duì)微核發(fā)生率無(wú)影響。

圖2 菜豆植物凝集素對(duì)小鼠骨髓微核發(fā)生率的影響Fig.2Micronucleus ratio of mice bone marrow cells by kidney bean lectin

3 討論

凝集素是一種非免疫源性的蛋白質(zhì)或糖蛋白，在植物、動(dòng)物及微生物中廣泛存在。豆科植物的凝集素由2個(gè)或4個(gè)單體組成，每個(gè)單體的分子量為25～30 kD，有一個(gè)糖結(jié)合位點(diǎn)［7］。糖蛋白在精子和卵細(xì)胞的識(shí)別和受精過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究表明，植物凝集素可以凝集包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物的精子［8］，并可以抑制小鼠的體外受精（IVF）；對(duì)胚胎發(fā)育也有一定的影響，不同的植物凝集素致突作用不同，其低劑量促進(jìn)胚胎發(fā)育，高劑量抑制胚胎發(fā)育；有效終止早、中、晚期的妊娠［9］。此外，還有研究表明部分植物的甘露糖結(jié)合凝集素可以抑制HIV的復(fù)制［10］，有望成為阻止艾滋病的流行和進(jìn)入快速傳播期的制劑。然而，植物中的凝集素種類繁多，豆科植物的凝集素就有600多種，如何從中篩選出具有醫(yī)用價(jià)值的凝集素種類是目前面臨的問(wèn)題。

在前期的研究中，筆者已收集了56個(gè)品種的菜豆，對(duì)其植物凝集素、皂甙、胰蛋白酶抑制劑以及植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子進(jìn)行了含量分析，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其毒性進(jìn)行的初步探索。本研究挑選植物凝集素含量分別為高、中、低3個(gè)級(jí)別，分析了其對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響，結(jié)果顯示菜豆植物凝集素與小鼠微核發(fā)生率呈劑量—反應(yīng)關(guān)系，但與陰性對(duì)照組微核發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明菜豆植物凝集素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)致突變作用，是相對(duì)安全的生物制劑的原料。

（References）

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［2］王昌梅，張麗芬，管榮花.不同方式給予植物凝集素對(duì)昆明白小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，39（1）：107-109.

［3］朱軒軒，周良雪，郭麗軍，等.蕓豆植物凝集素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響［J］.生物技術(shù)，2013，23（1）：79-82.

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［9］張麗芬.蕓豆植物凝集素（PHA）對(duì)小鼠體外受精及胚胎發(fā)育的影響［D］.昆明：云南師范大學(xué)，2010.

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（責(zé)任編輯：陳曠）

Analysis on Micronucleus Formation Induced by Kidney Bean Lectin

MOU Longmei，LIU Yizi，LI Jianan*
（Department of Biotechnology，School of Life Science，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

ObjectiveTo research the effect on micronucleus formation induced by lectin from vari?eties of kidney beans.MethodsGiving the mice lectin of three kind of kidney beans by intraperito?neal injection for 6 days.Bone marrow cells were collected and microscope slides were prepared by Giemsa staining.Micronucleus ratio was analysed under a light microscope,then judged the mutagenic effect of different kidney bean lection.ResultsThere was no significant difference between experi?ment group and negative control group，but positive group was obviously higher than experiment group and negative control group（P＜0.05）.Micronucleus ratio had a dose-effect relationship，but it was independent with gender.ConclusionThe three levels of lectin of three kind of kidney beans have no effect on micronucleus formation of bone marrow cells in mice，they can be used for development of biological preparations.

kidney bean；lectin；micronucleus test；mutagenic effect

R965.3

A

1673-0143（2014）06-0078-04

2014-08-13

牟龍妹（1994—），女，研究方向：生物技術(shù)。

*通訊作者：李佳楠（1978—），女，副教授，博士，研究方向：分子生物學(xué)。E-mail：lydian_l@163.com