趙曉輝++++++韓子強

[摘要] 目的 了解人附紅細胞體感染對小鼠白細胞凋亡的影響。方法 用流式細胞儀對白細胞凋亡以及CD4+ 和CD8+ T 淋巴細胞亞群的動態(tài)變化規(guī)律進行檢測。結果 感染后CD4+ 和CD8+ T淋巴細胞比例下降，CD4+ T 淋巴細胞比例在感染后第3天和第5天分別由感染前的12.89% 下降到10.83% 和6.34%，CD8+ T 淋巴細胞比例由感染前的8.31% 分別下降到6.16%和4.32%。白細胞凋亡的檢測顯示， 感染初期感染組凋亡細胞顯著高于對照組。結論 人附紅細胞體誘導細胞凋亡是導致免疫抑制和免疫細胞減少的主要原因。

[關鍵詞] 人附紅細胞體；小鼠； 白細胞； 細胞凋亡

[中圖分類號] R725；S858.28 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）13-0007-03

附紅細胞體（Eperythrozoon）是寄生于紅細胞表面、血漿及骨髓中的一群微生物，能導致人和動物的附紅細胞體?。‥perythrozoonosis）。自1928年Schilling和Dinger 等分別在嚙齒類動物中查到該病原體后，迄今全世界已有30多個國家和地區(qū)對此報道。近幾年，學者主要對附紅細胞體所寄生的紅細胞及紅細胞免疫學方面研究較多[1]，而未發(fā)現(xiàn)有關人附紅細胞體對白細胞影響變化的報道。為了解人附紅細胞體感染后宿主機體免疫情況的變化，本實驗對人附紅細胞體感染小鼠后外周血白細胞變化、白細胞凋亡的變化及CD4+和CD8+T 淋巴細胞亞群變化進行檢測，為進一步研究人附紅細胞體感染人群附紅細胞體病提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

SPF級BALB/c小鼠，購自泰山醫(yī)學院實驗動物中心，共36只，雌雄各半，6～8周齡，體重22～24 g。人附紅細胞體陽性血液通過醫(yī)院確診的人附紅細胞體感染陽性的患者采??；從美國羅氏公司購買的ACTGene Annex in V-FITC細胞凋亡試劑盒；從美國BD公司購買的用熒光標記的CD3+、CD4+和CD8+單克隆抗體。

1.2 樣品采集

將36只小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組18只，隔離飼養(yǎng)。實驗組經(jīng)腹腔接種附紅細胞體懸液0.5 mL/只，對照組經(jīng)腹腔接種生理鹽水0.5 mL/只，分別于感染第1、3、5、7、9天經(jīng)心臟取血，肝素抗凝。

1.3 外周血白細胞及白細胞凋亡檢測

采集的抗凝血用BC-2000血液細胞分析儀檢測白細胞總數(shù)量。根據(jù)細胞凋亡試劑盒說明書使用程序，用Annex in V-FITC和PI雙試劑對白細胞進行染色，通過流式細胞儀雙通道檢測熒光信號[2]。

1.4 CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群檢測

按照檢測試劑和儀器說明書，應用流式細胞術檢測。取肝素抗凝血樣本100 μL分別加入CD3+、CD4+和CD3+、CD8+單克隆抗體對照10 μL，室溫避光孵育30 min，加入溶血素溶解紅細胞后，1500轉(zhuǎn)/min，離心5 min， 棄上清，用PBS 重新懸浮細胞，過濾網(wǎng)過濾樣本后上機檢測[3-4]。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白細胞總數(shù)的變化

感染后實驗組小鼠外周白細胞總數(shù)量顯著減少，白細胞總數(shù)量平均值由感染前的4.95×109/L，下降到感染后第5天的3.27×109/L，與感染前比較差異顯著（P<0.05）。感染后第9天減少至2.89×109/L，僅為感染前的白細胞總數(shù)的58.4%，與感染前比較，差異顯著（圖1）。對照組白細胞總數(shù)在實驗前后沒有明顯變化。

圖1 人附紅細胞體感染小鼠白細胞總數(shù)的變化

2.2 白細胞凋亡的變化

對實驗組和對照組小鼠白細胞進行凋亡檢測，實驗組在感染后第3天和第5天，小鼠白細胞凋亡的比例顯著高于對照組，特別是在第5天，實驗組小鼠白細胞凋亡數(shù)占細胞總數(shù)平均值8.17%，對照組小鼠白細胞凋亡數(shù)平均值1.2%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在第7、9天，實驗組與對照組白細胞調(diào)亡數(shù)白細胞總數(shù)比較不顯著。

2.3 CD4+、CD8+ T淋巴細胞的變化

分別在感染后第3、5、7、9天采集外周血，檢測小鼠CD4+、CD8+T淋巴細胞的變化。結果是感染前實驗組小鼠CD4+、CD8+T淋巴細胞數(shù)占T淋巴細胞總數(shù)的百分比分別為12.89%和8.31%，感染后百分比逐漸降低。在第3天，CD4+、CD8+ T淋巴細胞顯著減少，分別下降到10.83%和6.16%；感染后第5天，分別為6.34%和4.32%。但在感染后第7天，CD4+、CD8+ T淋巴細胞比例上升，到第9天，分別為6.54%和4.78%（圖2）。

圖2 人附紅細胞體感染小鼠CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群的變化

3 討論

附紅細胞體病是一種新型人獸共患性疾病，動物方面的流行報道及相關研究居多，而關于人附紅細胞體的感染報道及研究較少。據(jù)王柯棣[5]等報道人附紅細胞體在全國廣泛流行，包括不同地域的城市和農(nóng)村都有報道[6-7]。不同地域的感染率都不同，有的地方人群的感染率達到了40%以上，應引起當?shù)夭块T重視。相對人附紅細胞體病的探索也僅僅在診斷方式、臨床治療藥物等應用性臨床研究。關于在附紅細胞體病的分類、不同宿主附紅細胞體的感染途徑及生物學特征以及對機體免疫系統(tǒng)的影響等方面還沒有明確的報道[8]。本實驗在前期的研究基礎上，對人附紅細胞體感染小鼠白細胞研究具有重要參考意義。

通過實驗，我們發(fā)現(xiàn)人附紅細胞體感染小鼠引起外周白細胞數(shù)量減少，與大部分細菌感染機體后，導致炎癥發(fā)生，引起白細胞增多情況不同。根據(jù)流行病學調(diào)查，人群中附紅細胞體感染大多不表現(xiàn)臨床癥狀，沒有炎癥的發(fā)生，只有在免疫力降低或者患慢性消耗性疾病時，才發(fā)生感染發(fā)病[9]，具有機會致病菌的的特點。由于該微生物附在紅細胞上或者游離在血液中，學者們對紅細胞體免疫研究較多，而對附紅細胞體與白細胞關系研究很少，因此人附紅細胞體感染導致白細胞減少與感染疾病的相關性還需要進一步研究。

本次我們采用流式細胞儀分析在人附紅細胞體感染后，小鼠外周CD4+、CD8+ T淋巴細胞和白細胞凋亡變化，首次描述了人附紅細胞體感染后外周血免疫細胞的消長變化情況。本實驗使用Annexin-V-FITC-PI 雙標法，能很好分開活細胞、壞死細胞及凋亡細胞。本實驗結果顯示，白細胞凋亡在人附紅細胞體感染后前5天，凋亡比例逐漸增加，而在第7、9天凋亡數(shù)與對照組相比較差異并不顯著。白細胞凋亡過程是生化變化、基因調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導及酶激活等多方面作用的結果， 受多因子調(diào)節(jié)， 其機制目前還不太清楚。迄今為止，人附紅細胞體感染導致外周白細胞凋亡研究未見報道，是否與其誘導或抑制原癌基因bc1-2及其相關基因有關，還需要進一步研究。楊朋艷等[10]報道，豬附紅細胞體感染小鼠后淋巴細胞總數(shù)顯著減少，另據(jù)楊蕾芳等[11]報道TH17細胞可能在附紅細胞體染過程中發(fā)揮了一定的免疫調(diào)節(jié)，而趙里等[12]報道樹突狀細胞可能發(fā)揮了負性調(diào)節(jié)作用。本實驗測定人紅細胞體感染后，CD4+、CD8+ T淋巴細胞亞群顯著減少，由此可推斷人附紅細胞體感染誘導的白細胞及T淋巴細胞減少可能導致感染初期機體的免疫抑制，從而為人附紅細胞體感染機體的免疫學研究提供數(shù)據(jù)。

[參考文獻]

[1] 李國蘭，楊玉芝，郭嶺，等. 附紅細胞體研究進展[J]. 中國病原生物學雜志，2008，3（8）：629-630.

[2] 楊漢春. 動物免疫學[M]. 第2版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2003：371-373.

[3] 鄭敏，熊娟，趙驥. 大蒜多糖C對正常小鼠外周血淋巴細胞亞群的影響[J]. 咸寧學院學報（醫(yī)學版），2007，21（1）：9-12.

[4] 張洋，朱寶芹，閻國輝，等. 三種小鼠外周血淋巴細胞亞群正常值比較[J]. 中國比較醫(yī)學雜志，2007，17（8）：12-15.

[5] 王柯棣，王章云. 附紅細胞體病研究進展[J]. 教育教學論壇，2012，37：29-31.

[6] 文海蓉，熊麗，吳景文，等. 南昌地區(qū)人體附紅細胞體流行病學調(diào)查[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學，2012，39（17）：4361-4362.

[7] 石泉貴，李素芝，陳洪章. 高原人附紅細胞體研究概況[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志，2012，33（20）：2452-2455.

[8] 司唯，姚琳，賈立軍，等. 豬附紅細胞體感染途徑研究[J]. 動物醫(yī)學進展，2012，33（12）：85-87.

[9] 尚德秋，陸光宇. 附紅細胞體感染人畜的流行病學調(diào)查（Ⅲ）[J]. 中華流行病學雜志，1997，17（3）：150-152.

[10] 楊朋艷，梁晚楓，張守發(fā). 豬附紅細胞體感染BALB/c小鼠試驗研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2012，28（23）：69-72.

[11] 楊蕾芳，巴彩鳳. 流式細胞術檢測小鼠感染附紅細胞體后TH17細胞的表達[J]. 中國人獸共患病學報，2012， 28（4）：347-350.

[12] 趙里，單思，巴彩鳳. 豬附紅細胞體對樹突狀細胞成熟的影響研究[J]. 中國農(nóng)學通，2013，29（32）：58-62.

（收稿日期：2014-02-25）

本次我們采用流式細胞儀分析在人附紅細胞體感染后，小鼠外周CD4+、CD8+ T淋巴細胞和白細胞凋亡變化，首次描述了人附紅細胞體感染后外周血免疫細胞的消長變化情況。本實驗使用Annexin-V-FITC-PI 雙標法，能很好分開活細胞、壞死細胞及凋亡細胞。本實驗結果顯示，白細胞凋亡在人附紅細胞體感染后前5天，凋亡比例逐漸增加，而在第7、9天凋亡數(shù)與對照組相比較差異并不顯著。白細胞凋亡過程是生化變化、基因調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導及酶激活等多方面作用的結果， 受多因子調(diào)節(jié)， 其機制目前還不太清楚。迄今為止，人附紅細胞體感染導致外周白細胞凋亡研究未見報道，是否與其誘導或抑制原癌基因bc1-2及其相關基因有關，還需要進一步研究。楊朋艷等[10]報道，豬附紅細胞體感染小鼠后淋巴細胞總數(shù)顯著減少，另據(jù)楊蕾芳等[11]報道TH17細胞可能在附紅細胞體染過程中發(fā)揮了一定的免疫調(diào)節(jié)，而趙里等[12]報道樹突狀細胞可能發(fā)揮了負性調(diào)節(jié)作用。本實驗測定人紅細胞體感染后，CD4+、CD8+ T淋巴細胞亞群顯著減少，由此可推斷人附紅細胞體感染誘導的白細胞及T淋巴細胞減少可能導致感染初期機體的免疫抑制，從而為人附紅細胞體感染機體的免疫學研究提供數(shù)據(jù)。

[參考文獻]

[1] 李國蘭，楊玉芝，郭嶺，等. 附紅細胞體研究進展[J]. 中國病原生物學雜志，2008，3（8）：629-630.

[2] 楊漢春. 動物免疫學[M]. 第2版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2003：371-373.

[3] 鄭敏，熊娟，趙驥. 大蒜多糖C對正常小鼠外周血淋巴細胞亞群的影響[J]. 咸寧學院學報（醫(yī)學版），2007，21（1）：9-12.

[4] 張洋，朱寶芹，閻國輝，等. 三種小鼠外周血淋巴細胞亞群正常值比較[J]. 中國比較醫(yī)學雜志，2007，17（8）：12-15.

[5] 王柯棣，王章云. 附紅細胞體病研究進展[J]. 教育教學論壇，2012，37：29-31.

[6] 文海蓉，熊麗，吳景文，等. 南昌地區(qū)人體附紅細胞體流行病學調(diào)查[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學，2012，39（17）：4361-4362.

[7] 石泉貴，李素芝，陳洪章. 高原人附紅細胞體研究概況[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志，2012，33（20）：2452-2455.

[8] 司唯，姚琳，賈立軍，等. 豬附紅細胞體感染途徑研究[J]. 動物醫(yī)學進展，2012，33（12）：85-87.

[9] 尚德秋，陸光宇. 附紅細胞體感染人畜的流行病學調(diào)查（Ⅲ）[J]. 中華流行病學雜志，1997，17（3）：150-152.

[10] 楊朋艷，梁晚楓，張守發(fā). 豬附紅細胞體感染BALB/c小鼠試驗研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2012，28（23）：69-72.

[11] 楊蕾芳，巴彩鳳. 流式細胞術檢測小鼠感染附紅細胞體后TH17細胞的表達[J]. 中國人獸共患病學報，2012， 28（4）：347-350.

[12] 趙里，單思，巴彩鳳. 豬附紅細胞體對樹突狀細胞成熟的影響研究[J]. 中國農(nóng)學通，2013，29（32）：58-62.

（收稿日期：2014-02-25）

本次我們采用流式細胞儀分析在人附紅細胞體感染后，小鼠外周CD4+、CD8+ T淋巴細胞和白細胞凋亡變化，首次描述了人附紅細胞體感染后外周血免疫細胞的消長變化情況。本實驗使用Annexin-V-FITC-PI 雙標法，能很好分開活細胞、壞死細胞及凋亡細胞。本實驗結果顯示，白細胞凋亡在人附紅細胞體感染后前5天，凋亡比例逐漸增加，而在第7、9天凋亡數(shù)與對照組相比較差異并不顯著。白細胞凋亡過程是生化變化、基因調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導及酶激活等多方面作用的結果， 受多因子調(diào)節(jié)， 其機制目前還不太清楚。迄今為止，人附紅細胞體感染導致外周白細胞凋亡研究未見報道，是否與其誘導或抑制原癌基因bc1-2及其相關基因有關，還需要進一步研究。楊朋艷等[10]報道，豬附紅細胞體感染小鼠后淋巴細胞總數(shù)顯著減少，另據(jù)楊蕾芳等[11]報道TH17細胞可能在附紅細胞體染過程中發(fā)揮了一定的免疫調(diào)節(jié)，而趙里等[12]報道樹突狀細胞可能發(fā)揮了負性調(diào)節(jié)作用。本實驗測定人紅細胞體感染后，CD4+、CD8+ T淋巴細胞亞群顯著減少，由此可推斷人附紅細胞體感染誘導的白細胞及T淋巴細胞減少可能導致感染初期機體的免疫抑制，從而為人附紅細胞體感染機體的免疫學研究提供數(shù)據(jù)。

[參考文獻]

[1] 李國蘭，楊玉芝，郭嶺，等. 附紅細胞體研究進展[J]. 中國病原生物學雜志，2008，3（8）：629-630.

[2] 楊漢春. 動物免疫學[M]. 第2版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2003：371-373.

[3] 鄭敏，熊娟，趙驥. 大蒜多糖C對正常小鼠外周血淋巴細胞亞群的影響[J]. 咸寧學院學報（醫(yī)學版），2007，21（1）：9-12.

[4] 張洋，朱寶芹，閻國輝，等. 三種小鼠外周血淋巴細胞亞群正常值比較[J]. 中國比較醫(yī)學雜志，2007，17（8）：12-15.

[5] 王柯棣，王章云. 附紅細胞體病研究進展[J]. 教育教學論壇，2012，37：29-31.

[6] 文海蓉，熊麗，吳景文，等. 南昌地區(qū)人體附紅細胞體流行病學調(diào)查[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學，2012，39（17）：4361-4362.

[7] 石泉貴，李素芝，陳洪章. 高原人附紅細胞體研究概況[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志，2012，33（20）：2452-2455.

[8] 司唯，姚琳，賈立軍，等. 豬附紅細胞體感染途徑研究[J]. 動物醫(yī)學進展，2012，33（12）：85-87.

[9] 尚德秋，陸光宇. 附紅細胞體感染人畜的流行病學調(diào)查（Ⅲ）[J]. 中華流行病學雜志，1997，17（3）：150-152.

[10] 楊朋艷，梁晚楓，張守發(fā). 豬附紅細胞體感染BALB/c小鼠試驗研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2012，28（23）：69-72.

[11] 楊蕾芳，巴彩鳳. 流式細胞術檢測小鼠感染附紅細胞體后TH17細胞的表達[J]. 中國人獸共患病學報，2012， 28（4）：347-350.

[12] 趙里，單思，巴彩鳳. 豬附紅細胞體對樹突狀細胞成熟的影響研究[J]. 中國農(nóng)學通，2013，29（32）：58-62.

（收稿日期：2014-02-25）