周修森 方永凱

河南省信陽市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 信陽 464000

頸腦康丸為河南省信陽市中醫(yī)院制劑室配制的口服制劑，由黃芪、雞血藤、丹參、地龍、葛根、威靈仙、紅花等十三味中藥組成。具有益氣活血，痛經(jīng)活絡(luò)的功效，臨床用于治療頸椎病、腦梗塞、腦血管病后遺癥及血管性腦供血不足等。該制劑中黃芪為君藥，本文以黃芪甲苷為指標(biāo)成分，參考有關(guān)文獻(xiàn)［1－5］，建立高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè) (HPLC－ELSD)法測(cè)定方中黃芪甲苷含量的方法，為該制劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 1525高效液相色譜儀、Waters 2420 ELS檢測(cè)器、Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器 (美國 Waters公司);METTLER AE－240電子分析天平 (梅特勒－托利多儀器有限公司);KQ－300型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);基因型1850D超純水機(jī) (重慶摩爾制水設(shè)備有限公司)。

1.2 材料 頸腦康丸 (河南省信陽市中醫(yī)院制劑室，批號(hào):20130518，20130611，20130706);黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào):110781－200613，中國藥品生物制品檢定所);色譜純乙腈 (河北四友卓越科技有限公司，批號(hào):130615);水為自制純化水;其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 反相高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈－水 (36∶64)，色譜柱為Agilent HCC18 Analytical(5μm，4.6mm ×250mm)，流速為 1.0 ml·min－1，漂移管溫度為70℃，氮?dú)饬髁繛?.8L·min－1，柱溫為25℃，進(jìn)樣體積為10μL，理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)應(yīng)不低于4000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h以上的黃芪甲苷對(duì)照品16.05mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液(含黃芪甲苷 0.1605mg·ml－1)。

2.2.2 樣品溶液［2－3］取本品10g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50ml，超聲40min(功率300W，頻率50kHz)，過濾，濾渣用甲醇洗滌2次 (每次10ml)，洗液并入濾液，濾液濃縮至干，殘?jiān)铀?5ml，微熱使溶解，通過D101型大孔吸附樹脂 (內(nèi)徑1.5cm，柱高12cm)，依次用水100ml、1%氫氧化鈉100ml、水200ml、30%乙醇100ml洗滌，棄去洗滌液，再用95%乙醇150ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方比例和工藝制備不含黃芪的空白制劑樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、樣品溶液和陰性對(duì)照溶液，按“2.1項(xiàng)”下色譜條件實(shí)驗(yàn)，結(jié)果:樣品溶液與對(duì)照品溶液一致，均在15.4min處出現(xiàn)黃芪甲苷峰，而陰性對(duì)照溶液在該位置處并沒有峰出現(xiàn)，說明用本法處理樣品制備供試液不產(chǎn)生假陽性干擾。色譜圖見圖1。

2.3.2 線性關(guān)系 在制備黃芪甲苷對(duì)照品溶液時(shí)，同時(shí)配制濃度為0.032、0.08、0.16、0.24、0.32mg·ml－1的系列對(duì)照品溶液，分別按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品溶液濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，峰面積值的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，線性回歸方程為:y=0.6615x－3.9805(r=0.9999)。表明黃芪甲苷在0.032～0.32 mg·ml－1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1項(xiàng)”下配制的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得黃芪甲苷峰面積的平均值為63917，RSD=0.92%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一制備樣品溶液 (批號(hào)20130518)，分別在0、1、3、5、8h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得峰面積的RSD=1.16%(n=5)，表明樣品溶液在8h內(nèi)丹參素含量穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次樣品 (批號(hào)20130518)，按“2.2.2項(xiàng)”下方法制備6份樣品溶液，按“2.1項(xiàng)”下色譜條件分別測(cè)定，結(jié)果該批樣品每10g中含黃芪甲苷的平均值為0.9129mg，RSD=1.71%(n=6)，表明所用方法重復(fù)性好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知準(zhǔn)確含量的樣品 (批號(hào)20130518)5g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50ml，再精密加入對(duì)照品溶液2.5ml，按“2.2.2項(xiàng)”下方法，平行制備6份供試液，依“2.1項(xiàng)”下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率 (%)，結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，所采用的測(cè)定方法準(zhǔn)確度高。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定 取頸腦康丸3批，分別按“2.2.2項(xiàng)”下方法制備樣品溶液，每批平行做3份，依“2.1項(xiàng)”下方法測(cè)定，計(jì)算出每10g中黃芪甲苷的平均含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 樣品溶液的制備 采用超聲提取和柱洗脫純化分離的方法制備樣品溶液。超聲提取技術(shù)利用高頻電磁波穿透提取介質(zhì)，到達(dá)物料內(nèi)部維管束和細(xì)胞，產(chǎn)生的電磁場(chǎng)還可加速被提取成分向提取溶劑界面擴(kuò)散，最大限度保證提取的質(zhì)量［2］;提取液過濾后，通過D101樹脂柱，經(jīng)水、堿水、稀醇溶液洗滌純化，乙醇洗脫，蒸干，甲醇溶解成供試品溶液。該方法提取效率高，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，避免了回流提取、水飽和正丁醇萃取分離的繁瑣操作，縮短了檢驗(yàn)流程，提高了工作效率，節(jié)省了人力物力。

3.2 檢測(cè)方法的選擇 黃芪甲苷在紫外光區(qū)屬于末端吸收，吸收波長(zhǎng)與所用溶劑甲醇的截止使用波長(zhǎng)相近，受溶劑及其組分的影響，可靠性和靈敏度較低。參照中國藥典2010年版一部［5］，采用通用性檢測(cè)器－蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

3.3 含量限度的確定 黃芪甲苷 (即黃芪苷IV)為羊毛酯醇形的四環(huán)三萜皂苷，是中藥黃芪的主要活性成分，在復(fù)方制劑中以黃芪為君藥測(cè)定其黃芪甲苷含量作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)是合理可行的;根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和處方中用量，擬定本品每10g含黃芪以黃芪甲苷 (C41H68O14)計(jì)，不得少于0.8mg。

［1］趙建邦，馬瀟．HPLC－ELSD測(cè)定補(bǔ)肺丸中黃芪甲苷的含量［J］．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(14):89－90．

［2］李莉，譚蔚，馬雪松．微波輔助提取黃芪甲苷的研究［J］．中藥材，2007，30(2):234－236．

［3］邢婕，秦雪梅，張麗增．HPLC－ELSD法測(cè)定黃芪甲苷含量供試品溶液制備方法改進(jìn)［J］．山西大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版)，2008，31(4):577－579．

［4］周修森，方永凱．HPLC法測(cè)定柴丹疏利膠囊中丹參素的含量［J］．西部中醫(yī)藥，2012，25(10):25－27．

［5］國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典 (一部)［M］．北京:中國醫(yī)藥出版社，2010:549．