許廣華 李小偉 韓 雙

安徽省太和縣中醫(yī)院，安徽 太和 236608

葛根為豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，為中風(fēng)常用的祛風(fēng)解毒藥之一，具有解肌，升陽(yáng)透疹，解熱生津等功效［1］，制劑處方中主藥葛根的有效成分為葛根素、黃豆苷、黃豆苷元等黃酮類(lèi)成分，其中葛根素的含量最高。頸痛舒口服液來(lái)自于我院推拿科主任、副主任醫(yī)師朱向陽(yáng)的經(jīng)驗(yàn)方，在長(zhǎng)期給予頸椎病患者治療過(guò)程中，除用推拿牽引等非藥物治療的同時(shí)服用頸痛舒口服液，以緩解病人因氣血不足，而引起的頭痛、頭暈、手臂麻木、酸痛、活動(dòng)不利等癥狀。為了有效控制該藥品的質(zhì)量，根據(jù)新藥審評(píng)有關(guān)規(guī)定，本文建立了測(cè)定頸痛舒口服液中葛根素含量的高效液相色譜法，結(jié)果分離度好、重現(xiàn)性好、靈敏度高，可作為控制頸痛舒口服液質(zhì)量的方法［2］。

1 儀器

北京普析L6－DP6型高效液相色譜儀 (生產(chǎn)廠家:北京普析通用設(shè)備科技有限公司);101－1A型數(shù)顯恒溫干燥箱 (生產(chǎn)廠家:上海光地儀器設(shè)備有限公司);AL－120型電子天平 (生產(chǎn)廠家:瑞士梅特勒－托利多儀器公司);ZF－2三用紫外儀 (生產(chǎn)廠家:上海安亭儀器廠);HS－180型超聲波清洗機(jī) (生產(chǎn)廠家:寧波海曙金蘭教儀科研究所);GSY電熱恒溫水浴鍋 (生產(chǎn)廠家:北京醫(yī)療器械廠)

2 試藥

頸痛舒口服液 (太和中醫(yī)院中藥制劑室，批號(hào):20130105，20130203，20130305);頸痛舒口服液陰性對(duì)照品三批 (太和縣中醫(yī)院中藥制劑室);葛根素對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物)。

色譜甲醇 (生產(chǎn)廠家:安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司);水為新制純化水;其余試劑均為分析純。

3 葛根素含量測(cè)定方法學(xué)

3.1 色譜條件 色譜柱:依利特Hypersil ODS(4.6mm×250mm，5um);流動(dòng)相:甲醇－水 (27∶73);檢測(cè)波長(zhǎng):250nm;流速:1.0ml/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μl。理論塔板數(shù)按葛根素峰計(jì)應(yīng)不低于4000，分離度大于1.5。

3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定葛根素對(duì)照品適量，加甲醇制成每ml含葛根素對(duì)照品50μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備［3］精密量取本品1.0ml，置50ml具塞錐形瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，超聲處理 (功率100W，頻率40kHz)30分鐘，濾過(guò)，取續(xù)濾液5ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.4 干擾試驗(yàn) 取按處方比例及生產(chǎn)工藝制備的不含葛根原藥材的頸痛舒口服液，按供試品溶液的制備同法制成陰性對(duì)照溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，葛根素含量測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 頸痛舒口服液HPLC色譜圖

3.5 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取葛根素對(duì)照品3.51 mg，置25 ml量瓶中，用30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密移取對(duì)照品溶液2，4，8，12，20μl，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程y=3.3E+6 x－31256，R=0.9998。結(jié)果表明，葛根素在0.2808～2.808μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.6 精密度試驗(yàn) 取葛根素對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果葛根素峰面積的RSD為0.87%。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，每份約1.0ml，按上述方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算葛根素含量。結(jié)果葛根素平均含量為3.52mg/ml，RSD為1.44%。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，室溫下放置，按上述色譜條件，分別于配制后0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄葛根素峰面積，結(jié)果葛根素峰面積的RSD為1.26%。

3.9 加樣回收率試驗(yàn)［4－5］精密量取已知含量的樣品6份，每份約1.0ml，分別精密加入葛根素對(duì)照品適量，按上述方法制成供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 葛根素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.10 樣品含量測(cè)定 取3批樣品，按上述方法制成供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果葛根素的含量分別為3.51，3.57，3.48mg/ml。

4 結(jié)果與討論

4.1 考察了甲醇－0.2%磷酸 (體積比27∶73)、乙腈－水(體積比20∶80)、甲醇 －水 (體積比27∶73)、甲醇 －0.1%磷酸 (體積比75∶25)［6］等流動(dòng)相，以甲醇-水(體積比27∶73)的保留時(shí)間較為適宜，且分離度良好，其余幾種條件葛根素保留時(shí)間短，分離度差。

4.2 對(duì)樣品超聲處理時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果表明樣品超聲時(shí)間30min以上，被測(cè)組分含量不再增加，說(shuō)明超聲時(shí)間30min即可，故將樣品處理的超聲時(shí)間定為30min。

4.3 采用HPLC法測(cè)定頸痛舒口服液中葛根素的含量，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，可用于頸痛舒口服液的質(zhì)量控制、穩(wěn)定性考察和有效期，可為頸痛舒口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

［1］劉玉國(guó)，修彥鳳，劉玉紅．葛根及其制劑中葛根素的含量測(cè)定方法概述［J］．基層中藥雜志，1999，13(1):42－44．

［2］陸煒琨，曾芳，李媛．反相高效液相色譜法測(cè)定益氣降糖膠囊中葛根素的含量［J］．廣州藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，26(5):475－477．

［3］張雪榮，董小燕，索偉．HPLC法測(cè)定頸復(fù)康顆粒劑中葛根素的含量測(cè)定［J］．中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2002，16(6):56－58．

［4］孫法麗，馬毅，王春香．高效液相色譜法測(cè)定葛瓜降糖膠囊中葛根素含量［J］．藥物鑒定，2007，16(20):33－34．

［5］宿潔，楊曉云，吳愛(ài)英．HPLC法測(cè)定天樂(lè)膠囊中的葛根素含量［J］．中國(guó)臨床藥學(xué)雜志，2003，12(2):94－95．

［6］劉必旺，李會(huì)芳，趙換，等．HPLC與TLC測(cè)定復(fù)方葛根膠囊中葛根素含量［J］．中華中醫(yī)藥雜志，2007，26(4):695－697．