李 闖，黃 璇,蔣桂韜，孫 鏖，戴求仲,※，龔炎長，彭秀麗

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙410131；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，湖北武漢430070）

家禽的人工授精技術(shù)在我國推廣應用始于上個世紀80年代，隨著人工授精技術(shù)的發(fā)展和完善，很好的解決了養(yǎng)殖過程中自然交配造成的受精率低、種蛋污染嚴重、孵化率低等問題。目前在養(yǎng)雞、養(yǎng)鴨生產(chǎn)中已經(jīng)得到普遍應用，養(yǎng)鵝生產(chǎn)中人工授精技術(shù)也在逐漸成熟。精液保存技術(shù)是家禽人工授精技術(shù)過程中最主要的環(huán)節(jié)，精液保存主要包括短期保存和長期保存（冷凍保存）。精液的體外保存時間對優(yōu)良種鴨精液的使用時間和范圍有重要影響，冷凍保存的精液還對種質(zhì)資源的長期保存有重要意義。

1 家禽精液的短期保存

1.1 家禽精液稀釋液的研究

半個多世紀以來，禽類精液稀釋液的研究取得了較大的突破。Lake[1,2]分析雞精液成分發(fā)現(xiàn)其由不同種化學物質(zhì)組成，其中谷氨酸是禽類精漿中最主要的陰離子組份，并首次配制了一種含有與公雞輸精管內(nèi)液體相同特性的化學成分的稀釋液（稱為Lake氏液），在精液保存24小時和48小時后，受精率分別達到64%和47%；為此提出使用與公雞輸精管內(nèi)液體滲透壓（－0.6℃冰點壓）相似并含有鉀、鈉、鎂和谷氨酸鹽的稀釋液，能增加精子的存活時間。國內(nèi)學者張兆旺[3,4]、姚希芳[5]等通過試驗也證實了谷氨酸鈉對精子有保護作用。張兆旺[6]通過試驗證明，檸檬酸的鈉鹽和鉀鹽也有延長精子體外保存壽命的功效。楊保田[7]通過研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸鈉溶液能有效的提高雞精子的生存指數(shù)。能源物質(zhì)是精子在體外存活不可缺少的部分，果糖對于提高貯存精液的受精力具有重要作用。蘇東頓[8]的研究結(jié)果也證明了果糖能提高精液的受精力。黃仁術(shù)[9,10]也通過試驗證明果糖的保存效果優(yōu)于葡糖糖和蔗糖。

稀釋液的pH值能影響精子的代謝率和活性，所以其應接近家禽精液的pH值。張兆旺[3]和劉宗政[11]認為雞精液稀釋液pH值在6.8～7.2之間效果最佳。姚希芳[6]在研究稀釋液pH值及滲透壓對雞精液保存效果的影響中指出雞精液稀釋液pH值在6.7～7.2之間對精子的生存最為適宜。李輝[12]認為雞精子在pH值為5.97～8.33的稀釋液中能保持較高受精能力，受精率最高達到94.2%。

當精子處于低滲環(huán)境，精子細胞得到水分將膨脹，同時精子的畸形率特別是頸部彎曲將大大增加；當精子處于高滲環(huán)境，精子細胞失去水分將萎縮。張兆旺[4,7,13]通過試驗表明雞精液稀釋液滲透壓應為等滲或接近等滲。禽類精子在滲透壓范圍250～460mOsM/kg·H2O的情況下能保持精子的活力。姚希芳[6]指出雞精子生存適宜的滲透壓是278～434mOsM/kg·H2O。楊保田[7]通過試驗也證實精液稀釋液滲透壓為等滲時精子活動時間最長。趙建軍[14]在研究滲透壓對雞精液低溫保存的影響中指出滲透壓為300mOsM/kg·H2O時精子存活時間、精子生存指數(shù)都優(yōu)于400mOsM/kg·H2O、500mOsM/kg·H2O。

1.2 稀釋比例和保存溫度的研究

采集到的家禽精液在輸精前對其進行適當?shù)南♂屇芴岣呔拥拇婊顣r間和能力，但如果稀釋倍數(shù)過高，會造成精子的受精力降低。因此，在稀釋精液時應選擇出最佳的稀釋倍數(shù)進行稀釋。胡松庭[15]等用雞原精液和不同的稀釋比例（1∶1、1∶2、1∶3）稀釋精液，試驗證明用雞原精液、1∶1和1∶2稀釋比例稀釋精液輸精后，得到的種蛋受精率差異不顯著（P>0.05）。朱慶[16]用1%NaCl液作為稀釋液，用雞原精液與1∶1和1∶2稀釋比例稀釋組進行受精率對比試驗，試驗結(jié)果表明雞原精液與1∶1稀釋組的受精率無顯著差異，但其受精率低于1∶2稀釋組。彭秀麗[17]認為雞精液1∶1稀釋時種蛋受精率較高。潘越博[18]研究雞精液稀釋比例對種蛋授精率的影響，試驗表明稀釋比例1∶1、1∶1.5、1∶2的受精率顯著高于原精液。林如龍[19]（2014）認為在半番鴨生產(chǎn)中按1∶1比例稀釋精液可以獲得較高的種蛋受精率。

精液短期保存根據(jù)溫度不同可分為常溫保存和低溫保存。常溫保存一般應用在人工授精過程中精液采集后立即輸精的過程，時間比較短暫，一般為0.5h，而低溫保存的保存時間一般超過24h。胡善虎[20]通過試驗證明雞精液在30～35℃之間保存并在半個小時內(nèi)輸精效果最為適宜。孫占田[21]采精后把精液分別保存在35℃、37℃、39℃溫度下半小時內(nèi)完成輸精，發(fā)現(xiàn)保存溫度39℃的受精率最佳。景棟林等[22]通過用不同稀釋液稀釋鴨精液，在2～5℃、8～10℃和25℃下保存24h后觀察精子活力發(fā)現(xiàn)，鴨精液液態(tài)保存的最適宜度為2～5℃。許月英等[23]用0.9%NaCl和牛奶2倍量稀釋鵝精液，分別在2～5℃、15～25℃、38～39℃和48.5℃溫度下保存，發(fā)現(xiàn)牛奶稀釋的鵝精液在2～5℃低溫條件下保存效果最好。

2 家禽精液的冷凍保存技術(shù)的研究

2.1 家禽精液冷凍保存技術(shù)的現(xiàn)狀

禽類精液的冷凍保存研究開始的比較早，早在20世紀40年代國外科學家用在－0.6℃條件下冷凍雞精液30秒后的解凍精液輸精，得到凍精條件下的第一只小雞[24]。在隨后的幾十年，大量的研究證明這一技術(shù)在生產(chǎn)實際中具有極為重要的意義。Polge[25]第一個用甘油作為冷凍保護劑對雞精液進行冷凍，解凍后的精子仍存在活力。在第2年的試驗中他首次用解凍后精液輸精并取得成功，但受精率很低。之后許多人都加入到對家禽精液冷凍技術(shù)的研究中，使冷凍技術(shù)得到了很大的發(fā)展。隨著人們的研究，研究的方向也有了很大的擴展，這些研究不光涉及到精液冷凍后精子形態(tài)的變化和精子結(jié)構(gòu)的變化，還涉及到冷凍保護劑的選擇、最佳平衡時間的確定、解凍溫度的選擇等，多方面的研究也使凍精輸精的受精率大大提高。Lake[26]用雞的精液冷凍后輸精得到的受精率達到90%，但鴨的冷凍精液只得到30%的受精率，鵝的冷凍精液每天輸精受精率為78.5%，而火雞的冷凍精液受精率則極低。俄國科學家K.Tselutin[27]用冷凍保存技術(shù)保存雞、火雞、鴨和鵝的精液，解凍精液輸精受精率為雞75%～85%，火雞80%～90%，鴨69%～90%，鵝81%～90%。

2.2 精液冷凍保護劑和冷凍方法的研究

Polge[25]一次偶然機會在對雞精液進行稀釋時加入了10%～15%甘油，用干冰在－79℃下冷凍精液，最后發(fā)現(xiàn)精子的活性可維持10周，稀釋液中加入甘油的出現(xiàn)徹底變革了精子冷凍保存原有的技術(shù)程序。甘油的出現(xiàn)使人們對家禽精液冷凍保護劑的研究逐漸增多，隨著研究的發(fā)展冷凍保護劑種類在逐漸增多，主要包括甘油、二甲基亞砜、乙烯乙二醇、二甲基甲酰胺（DMF）和丙基乙二醇等，這些冷凍保護劑中前四種已被國外許多的研究者所采用如表1[28]。Lake[29]用甘油作防凍劑對冷凍保存方法進行改進，對在－196℃液氮中保存2年半的雞精液進行解凍輸精，其受精率仍能達到80%。王紅軍[30]用DMA和EG按一定比例混合作為冷凍保護劑冷凍雞精液，取得了不錯的效果，精子畸形率明顯降低。黃素紅[31]指出用DMSO和DMA作為冷凍保護劑冷凍雞精液，對精子的保護效果最佳。任靜波[32]以DMA作為冷凍劑，冷凍保存鵝精液，解凍后精子活力為41%，受精率達到78.1%。王世銀[33]用濃度為6%的甘油作為冷凍保存劑時，對冷凍過程中雞精子的保護效果最好，凍后活力達到0.68，精子復蘇率達到97.5%。

一般來說，精液在平衡前先降溫到2～5℃，在此溫度下平衡一段時間后再進行冷凍。冷凍的方法可以參考表2[28]，對這些方法的輸精效果的比較研究目前還沒見報道。

2.3 平衡時間和解凍溫度的研究

精液在冷凍之前需要平衡一段時間后再進行冷凍，平衡的主要作用是讓冷凍保護劑能充分滲入精子內(nèi)部，使其滲透的活性物質(zhì)達到平衡，能在精液冷凍過程中起到保護作用。冷凍精液需要解凍之后復蘇精子活力后進行輸精，有學者把對精液的解凍方法分為高溫、溫水和低溫解凍三種，就目前研究的情況來看用溫水解凍對精液的保存效果最好。徐日福[34]通過試驗研究不同平衡時間和解凍溫度對雞精液冷凍保存效果的影響發(fā)現(xiàn)，認為最佳的平衡時間為30min，同時發(fā)現(xiàn)試驗發(fā)現(xiàn)雞冷凍精液在30℃、37℃和40℃解凍時的精子活力最高，所以得出對雞冷凍精液解凍時最佳解凍溫度是30～40℃。韓雪峰[35]用不同的冷凍保護劑對鴨精液進行冷凍，分別用不同的平衡時間解凍溫度處理鴨精液，實驗結(jié)果表明平衡時間為15min時冷凍精液的效果最佳，解凍溫度在40℃時，解凍后的精子活力都高于其他解凍溫度組。

3 小結(jié)

關(guān)于家禽精液的保存，由于雞、鴨、鵝等品種不同，其精液的許多生理學特性不同，精液在體外保存及維持活力需要的條件也不同。零度以上保存精液需要添加適當?shù)南♂屢杭右韵♂?，保存溫度?～5℃最為適宜；禽類冷凍精液在實驗階段受精率較高，但應用于實踐還有一些問題需要解決，如冷凍保護劑的選擇，通常我們選用的防凍劑都是甘油，這樣冷凍保存后能得到很高的精子活力，但甘油有毒性，用含有甘油的精液輸精后精子將喪失受精能力。冷凍程序各步所采取的措施也能影響受精率，冷凍程序各步間的聯(lián)系和相互作用對精子活力和受精率可能有影響，不同種類的公禽和同種公禽的不同個體之間，其精子的抗凍力可能也有遺傳差異?？傊?，禽類精液的保存還需要進一步的研究和發(fā)展，使其更好的應用于實踐生產(chǎn)當中。

（11～35 略，需要者可向作者索取）

[1]Lake P E, Mcindoe W M. The glutamic acid and creatine content of cock seminal plasma[Journal Article]. Biochem J. 1959, 71(2): 303-306.

[2]Lake P E. Studies on the dilution and storage of fowl semen[Journal Article].J Reprod Fertil.1960,（1）:30-35.

[3]張兆旺,張進邦. 雞精液稀釋液篩選試驗[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學學報,1992,（4）:333-338.

[4]張兆旺,姚希芳. 影響雞精液3℃下保存效果的因素[J].中國家禽,2002,（13）:26.

[5]姚希芳. 稀釋液pH 值及滲透壓對3～5℃下雞精液保存效果的影響[J]. 甘肅畜牧獸醫(yī),2002,（5）:5-7.

[6]張兆旺. 稀釋液溶質(zhì)和滲透壓對雞精子體外存活及形態(tài)的影響[J]. 中國家禽,2001,（8）:50-52.

[7]楊保田,牛盛模. 稀釋液溶質(zhì)及滲透壓對雞精液低溫保存效果的影響[J]. 甘肅畜牧獸醫(yī),2006,（6）:21-22.

[8]蘇東頓,丁余榮,王桂朝,劉國榮. 提高肉用種雞人工授精效果的研究Ⅴ——肉用種雞精液稀釋液的篩選[J]. 中國家禽,1993,（4）:20-21.

[9]黃仁術(shù). 常溫下基于Lakes 液的皖西白鵝精液稀釋液研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學,2009,（1）:125-126+130.

[10]黃仁術(shù). 低溫下基于Lakes 液的皖西白鵝精液稀釋液研究[J]. 畜牧與獸醫(yī),2009,（3）:62-64.