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腦泡狀棘球蚴病兔腦動物模型建立

2014-07-13 06:39:52田兄玲劉叢學(xué)張黎敏張德清
關(guān)鍵詞:頭節(jié)泡狀顱骨

田兄玲, 劉叢學(xué), 張黎敏, 姜 濤, 張德清, 王 儉

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1影像中心, 2醫(yī)院動物研究中心, 烏魯木齊 830054)

包蟲病是一種人、畜共患的傳染性疾病,廣泛流行于全球畜牧業(yè)為主的地區(qū)。泡型包蟲病(alveolar echinococcosis,AE)的發(fā)生率僅占包蟲病總發(fā)生率的3%左右;人類患腦泡狀棘球蚴病的發(fā)生率極低,僅占1%~2%。雖然患者數(shù)量較少,但危害程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)比細(xì)粒棘球蚴病嚴(yán)重。因腦泡狀棘球蚴病的自然發(fā)生率較低,臨床研究工作開展困難。本研究采用3種不同的接種方法建立腦泡狀棘球蚴病新西蘭大白兔模型,旨在建立操作簡便、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性強的理想動物模型,為腦泡狀棘球蚴腦病的基礎(chǔ)、臨床等各項研究提供一個支持平臺。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組健康清潔級新西蘭大白兔45只,雌性,兔齡1.5~2個月,體質(zhì)量1.8~2.0 kg,由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[許可證號:SYXK(新)2003-0001]。實驗操作過程符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》要求。本實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會論證、批準(zhǔn)實施(審批號:A-20090611002)。新西蘭大白兔適應(yīng)性飼養(yǎng)2 w后,隨機分為兩組:A組25只,B組20只。A、B組動物均經(jīng)顱骨穿刺直接于腦組織內(nèi)接種泡狀棘球蚴病原頭節(jié)。

1.2主要儀器及試劑GE Signa 3.0T超導(dǎo)磁共振掃描儀,表面線圈。超凈工作臺Olympus-CKX31倒置顯微鏡及光學(xué)顯微鏡,F(xiàn)A1004電子天平,恒溫水浴箱,ZH-藍(lán)星C立體定位儀。4.305 g/15 mL釓雙胺(歐乃影)注射用造影劑,泡狀棘球蚴病免疫4項試劑盒。

1.3MRI檢查技術(shù)及參數(shù)全部動物均行平掃、釓對比劑增強及擴散加權(quán)成像檢查。采集軸位、矢狀位、冠狀位。T1WI Flair、T2WI FSE及T2 Flair圖像;層厚3 mm,層距0.3 mm,F(xiàn)OV 12 cm,采集次數(shù)2~3次。T1 Flair增強,釓雙胺注射液0.2 mL/kg體質(zhì)量,耳緣靜脈高速度注射。擴散加權(quán)成像采用軸位,SE-EPI序列:重復(fù)時間(TR)6000 ms,回波時間(TE)60 ms,采集次數(shù)1次,b值為0 s/mm2和1 000 s/mm2,擴散梯度場施加在相位編碼、層面選擇及頻率編碼方向上。

1.4實驗方法

1.4.1 接種液制備及活性鑒定

1.4.1.1 接種液制備 泡狀棘球蚴保種鼠(甘肅屬灰倉鼠,體質(zhì)量約為80 g,3只)由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心提供,制備過程在專業(yè)獸醫(yī)指導(dǎo)和嚴(yán)格質(zhì)量控制下完成。頸椎脫臼法處死泡狀棘球蚴保種鼠,自保種鼠腹膜、腹腔及胸腔內(nèi)取出新鮮泡狀棘球蚴病灶,肉眼去除病變附著、壞死、鈣化等組織;組織剪碎,輕度碾磨,生理鹽水混勻漂洗,3層無菌沙布過濾4~6次;過濾液經(jīng)5~8 min沉淀,7號注射器針頭抽取沉淀的原頭節(jié)及囊壁生發(fā)膜。將沉淀物加入適量生理鹽水與青霉素(40 IU/mL)混液,制備成(3~5)×103個/mL及(5~10)×103個/mL泡狀棘球蚴原頭節(jié)混懸液,保存于0~4℃保溫盒,以備接種。

1.4.1.2 接種液活性鑒定 不同濃度的原頭節(jié)混懸液0.5 mL,經(jīng)0.5%伊紅染色5 min,囊液低速離心取沉淀,PBS洗滌,取約100 μL均勻涂于載玻片上,有活性蟲體拒染,而死亡的蟲體著色,鏡下確定具有活性的蟲體數(shù)(蟲體數(shù)>80%),見圖1。

1.4.2 動物模型制備 取5%氯胺酮2 mL、安定2 mL、阿托品 1mL,用生理鹽水稀釋至20 mL,按5 mL/kg體質(zhì)量經(jīng)耳緣靜脈推注,麻醉實驗動物。動物取俯臥位,腦立體定位儀固定頭部,脫除顱頂毛發(fā);75%碘伏消毒,正中開口,剝離脂肪層、肌層及筋膜,暴露顱骨;于前囟正后方2.5 cm、矢狀縫偏右0.5 cm處,用克氏針垂直鉆開直徑約1 mm的小孔,A組與B組分別用1 mL注射器斜前外側(cè)進針約1 cm和0.3~0.5 cm,然后均注入(5~10)×103個/mL泡狀棘球蚴原頭節(jié)的混懸液約0.2 mL;注射針顱腔置留1 min左右,拔針,紗布按壓約3 min;縫合,留觀30 min,送回飼養(yǎng)房。兔舍室溫恒定在18~23℃,自由飲水。每日觀察手術(shù)切口,碘伏消毒;皮下注射先鋒Ⅴ(0.1 g/d),補液2 mL/d,3~5 d。記錄動物進食水、精神狀況、排尿便顏色和清亮度等。

圖1 泡狀棘球蚴原頭節(jié)光鏡圖(×50)

1.4.3 MRI檢查 分別于接種后30、60、90 d,應(yīng)用美國GE Signa 3.0T超導(dǎo)磁共振掃描儀對所有動物進行掃描。動物麻醉,俯臥于特制檢查平板上,表面線圈包繞頭部。頭先進,定位于顱骨正中、眼球正中后方約1 cm處。MRI常規(guī)及增強檢查。

1.4.4 標(biāo)本病理檢查 過量麻醉處死實驗動物,分離病變腦組織;肉眼觀察病變,10%福爾馬林液固定12 h后蠟封、切片,顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1建模成功率及MRI、病理檢出率實驗A、B組建模成功,病理檢出率為100%,分別有5只(26.32%)及1只(5.56%)動物成功接種腦泡狀棘球蚴病。建模成功的實驗動物磁共振檢查腦泡狀棘球蚴病情況:90 d磁共振檢出率為100%,60 d磁共振檢出率為66.67%,30 d磁共振檢出率為33.33%。

2.2病理結(jié)果

2.2.1 肉眼觀察結(jié)果 6只成功模型均為單發(fā)病灶;A組5只病灶均位于腦皮質(zhì),靠近顱底腦膜及基底動脈環(huán);B組1只病灶位于髓質(zhì)內(nèi),靠近側(cè)腦室壁;病灶0.31~1.23 cm;灰白色,團塊,不能完全與腦組織分離;切開病灶內(nèi)為無結(jié)構(gòu)果凍樣物質(zhì),質(zhì)軟,有彈性;A組2只病灶內(nèi)有點狀暗紅色結(jié)節(jié),1只病灶內(nèi)有顆粒狀黃色物質(zhì);所有病灶內(nèi)部均無壞死液化樣物質(zhì),無血管樣結(jié)構(gòu)。

2.2.2 HE染色及顯微鏡觀察結(jié)果 HE染色后為泡狀棘球蚴病,僅見角皮層而不見生發(fā)層,囊內(nèi)無頭節(jié),周圍可見炎細(xì)胞反應(yīng),大量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤,伴鈣化見圖2。

圖2 接種90 d后腦泡狀棘球蚴病病理圖(×400)

2.3磁共振檢查結(jié)果病灶多呈結(jié)節(jié)樣稍長T1稍長T2信號,T2 Flair呈稍高信號,病灶無明確邊界,周圍見輕中度環(huán)狀水腫影。釓噴酸葡胺對比增強病灶呈不規(guī)則環(huán)狀強化。

3 討論

目前,臨床診斷泡狀棘球蚴腦病主要依據(jù)影像學(xué)檢查及實驗室檢查,但當(dāng)常規(guī)影像學(xué)檢查出現(xiàn)異常時,病程已進入晚期階段,常見多臟器受累的表現(xiàn)。泡狀棘球蚴腦病病變多位于大腦皮層或皮層下區(qū),廣泛者可累及側(cè)腦室并可壓迫、侵蝕顱骨,出現(xiàn)顱骨隆凸。該病的危害與其生長方式緊密相關(guān),病變進展過程中,泡型棘球蚴以內(nèi)殖性和外殖性芽生方式增殖,像惡性腫瘤一樣呈浸潤性生長[1],因此又稱為“寄生蟲腫瘤”或“蟲癌”。因此早期診斷泡狀棘球蚴腦病并及早干預(yù)有可能成為提高患者預(yù)后的突破點。

因腦泡狀棘球蚴病自然發(fā)生率較低,臨床研究工作開展困難。既往模型多為大鼠模型,苗玉清等[2]采用泡球蚴混懸液人工感染小鼠腹腔,成功建立了感染泡球蚴病的動物模型,接種成功率>95%,為小鼠泡球蚴保種及動物模型的建立提供了豐富的經(jīng)驗,且操作簡便,接種成功率高。有研究報道,選用小鼠與沙鼠,同時經(jīng)額骨在顱腔內(nèi)直接注入囊懸液及腹腔經(jīng)門脈感染實驗動物的方式,結(jié)果顯示經(jīng)額骨的方法建模5個月,小鼠顱腔內(nèi)可見含有頭節(jié)的片層狀泡球蚴囊,而經(jīng)門脈感染的小鼠僅在顱腔、腦室內(nèi)可見極少量泡球蚴囊,但腦實質(zhì)內(nèi)未見泡球蚴囊[3]。

本實驗選用體型中等、性情溫順的新西蘭大白兔為實驗動物,運用經(jīng)顱骨直接穿刺注射泡球蚴混懸液的方法,經(jīng)過血清免疫學(xué)及病理學(xué)檢查證實成功建立腦泡狀棘球蚴病新西蘭大白兔模型6只。較既往大鼠模型研究具有如下的優(yōu)勢:(1)兔腦模型結(jié)構(gòu)、大小均比大鼠更理想,易于接種及影像操作;(2)應(yīng)用臨床常規(guī)MRI的頭顱線圈,就能夠獲得滿意的MRI圖像,不需要額外購買昂貴的動物線圈,節(jié)約了研究成本,有利于研究方法的推廣和應(yīng)用;(3)經(jīng)顱骨直接穿刺注射泡球蚴混懸液方法簡單易行,實驗動物創(chuàng)傷小、恢復(fù)快,可有效降低實驗動物的死亡率,有利于后期研究。

溫浩等[4]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)顱骨接種泡狀棘球蚴原頭節(jié)顱內(nèi)感染小鼠具有可行性,且接種成功率高。本研究所采用的方法實驗周期短,操作簡便,對實驗動物創(chuàng)傷小。A組方法接種點較深,位于顱腦底部,貼近腦膜及顱動脈環(huán)的位置;B組接種點位于較淺的腦實質(zhì)內(nèi)。結(jié)果表明,A組接種成功率(26.32%)明顯高于B組(5.56%)。分析可能原因:A組接種點靠近腦表面,是血管豐富的區(qū)域,原頭節(jié)更易著床獲取生長需要的營養(yǎng)物質(zhì),易于增生繁殖;B組接種點位于腦實質(zhì)內(nèi),灶周血供不如腦表面豐富;接種后局部腦組織出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng),促發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng),進而使血腦屏障(BBB)通透性增加而導(dǎo)致血管源性腦水腫。血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能持續(xù)性受損,形成惡性循環(huán),可能也會間接或直接影響到接種的成功率。經(jīng)顱骨穿刺直接接種法可直接快速地感染實驗動物腦組織,腦組織柔軟阻力小,且血供豐富,病灶生長快速。兔腦容積較小,本實驗中部分感染動物因腦組織損傷(出血、梗死等)、腦內(nèi)占位、腦積水、顱內(nèi)感染等因素,后期出現(xiàn)明顯神經(jīng)癥狀,甚至死亡。

本實驗經(jīng)由顱骨穿刺直視下的接種途徑,使用濃度相同的泡狀棘球蚴原頭節(jié)混懸液,但采用不同穿刺深度進行腦泡狀棘球蚴病模型建立,結(jié)果證明了方法的可行性,但接種率并不高。原因可能是:(1)實驗動物顱腔小,磁共振特殊序列圖像受影響大;(2)機體免疫反應(yīng)是接種率低的主要原因,應(yīng)考慮如何降低機體免疫,或人為建立寄生蟲的免疫逃避;(3)病理檢測的標(biāo)本采集不全面,應(yīng)擴大采集范圍,如顱腔、腦室壁、腦脊液、病灶周圍組織等均應(yīng)列入檢測標(biāo)本范圍以內(nèi)。

綜上所述,通過顱骨穿刺直視下腦內(nèi)接種方法制作腦泡狀棘球蚴病新西蘭大白兔模型更易成功,接種點應(yīng)靠近血管豐富的區(qū)域;腦泡狀棘球蚴兔腦模型為進一步深入研究腦泡狀棘球蚴病磁共振成像的早期診斷提供了技術(shù)平臺。

參考文獻:

[1] Bammer R.Basic principles of diffusion-weighted imaging[J].Eur J Radiol,2003,45(1):169-184.

[2] 苗玉清, 王瑞玲. 建立人工感染泡球蚴小鼠模型的體會[J]. 中國局解手術(shù)學(xué)雜志, 2000, 9(1):51-52.

[3] Will C,袁曉園. 腦包蟲模型:鼠腦多房棘球蚴的實驗性感染[J]. 國外醫(yī)學(xué):寄生蟲病分冊,1999,26(2):88-89.

[4] 溫浩, 徐明謙. 實用包蟲病學(xué)[M]. 北京:科學(xué)技術(shù)出版社,2010:28-35.

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