劉高成， 吳佩玲， 步 江， 白新華

(1烏魯木齊市口腔醫(yī)院口腔科， 烏魯木齊 830002； 2新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科， 烏魯木齊 830000)

牙髓是疏松的結(jié)締組織，主要功能在于形成、營養(yǎng)、防御和修復(fù)牙本質(zhì)，在修復(fù)過程中需要一系列生長因子介導(dǎo)。血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 是高度特異且具有多功能的細胞因子，不僅參與組織胚胎器官生長發(fā)育，還與炎癥、創(chuàng)傷愈合和缺血性組織的修復(fù)再生有關(guān)。Janebodin等[1]報道人牙髓組織存少量VEGF，可誘導(dǎo)人牙髓細胞的趨化性能，促進牙髓細胞的增殖與分化，不同牙髓狀態(tài)對VEGF的表達有影響。Matsushita等[2]報道動物VEGF表達呈增齡性，通過干預(yù)VEGF表達可達到治愈牙髓病的目的。目前有關(guān)VEGF 在人恒牙牙髓組織的表達的研究較少，本研究分析VEGF 在人年輕恒牙及成熟恒牙牙髓中的表達。

1 對象和方法

1.1研究對象收集2010年6月-2013年10月在新疆醫(yī)科大學(xué)二附院口腔科行正畸治療而需拔除的無齲健康的第一前磨牙56顆，包括年輕恒牙30顆和成熟恒牙26顆。年輕恒牙情況：牙根發(fā)育1/3～3/4，年齡6～18歲，男性20顆，女性10顆；成熟恒牙情況：年齡26～41歲，男性15顆，女性11顆。牙拔除后置于10%中性福爾馬林固定液中固定，4℃下固定48 h。排除伴全身系統(tǒng)性疾病者、哺乳期或懷孕婦女、近2個月服用抗菌素和/或免疫制劑者。

1.2指標檢測將固定的標本置于10%EDTA沖洗，采用脫鈣液持續(xù)脫鈣10 w，將脫鈣的標本置于脫水機，脫水后浸蠟包埋，沿牙體中線自牙根向牙冠連續(xù)切片，每片厚4 μm[3]。采用常規(guī)免疫組化鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(Srteptvadin-bitin Complex，SABC)法進行VEGF 抗體染色，PBS 緩沖液代替一抗為對照，DAB顯色，中性樹膠封片，4℃保存。以細胞質(zhì)與基質(zhì)染成斑點、顆粒或連續(xù)線狀的黃棕色為VEGF陽性表達。

1.3評判標準將染色強度分為：0級(-)：未出現(xiàn)著色顆粒；Ⅰ級(+)：呈黃色，染色弱，高倍視野陽性細胞數(shù)<30%；Ⅱ級(++)：染色清晰，呈棕黃色或深黃色，高倍視野陽性細胞數(shù)>30%，利用圖像分析儀和Meta Morph/Cool snapfx/AX70軟件對陽性染色部位的透光強度(灰度值)定量分析。

2 結(jié)果

2.1年輕和成熟恒牙的VEGF分布與分布強度比較牙髓組織的VEGF 在成纖維細胞呈陽性，恒牙牙髓成纖維細胞的 VEGF 均呈陽性表達，但年輕恒牙的VEGF表達為強陽性，年輕恒牙牙髓中部呈強陽性表達，根部與冠部VEGF陽性表達明顯較弱；成熟恒牙牙髓中部呈陽性表達，根部與冠部VEGF陽性表達明顯較弱，見圖1。

注: 1、2、3為年輕恒牙的牙髓冠部、中部和根部；4、5、6為成熟恒牙的牙髓冠部、中部和根部。

2.2VEGF在年輕和成熟恒牙不同部位的表達比較年輕恒牙牙髓成纖維細胞中的VEGF呈強陽性表達，向冠部和根部表達逐漸減弱；成熟恒牙牙髓成纖維細胞中的VEGF呈陽性表達，向冠部和根部表達逐漸減弱。與年輕恒牙比較，成熟恒牙牙髓成纖維細胞中的VEGF表達較弱，在冠部和根部的表達較弱，見表1。

表1 VEGF在恒牙的表達水平

3 討論

牙髓(endodontium)是疏松的結(jié)締組織，牙體組織中唯一的軟組織，位于牙本質(zhì)所形成的髓腔內(nèi)，由細胞、纖維、血管、神經(jīng)和淋巴等組成，牙髓細胞又稱成纖維細胞，成纖維細胞呈星形，是牙髓的主要細胞，也是牙髓生物功能實現(xiàn)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，牙髓的主要功能為形成、營養(yǎng)、保護和修復(fù)牙本質(zhì)[4]，其保護功能的實現(xiàn)需要一系列生長因子，如VEGF、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等，其中VEGF是由牙髓細胞分泌且血管生成作用最強的因子，VEGF對提高血管的通透性、促使內(nèi)皮細胞分裂、生成血管進而調(diào)節(jié)破骨細胞分化和增殖具有重要意義，其提高血管通透性的效能是組胺的5萬倍[5-7]。

本研究顯示，年輕恒牙的牙髓成纖維細胞中的VEGF呈強陽性表達，向冠部和根部表達逐漸減弱；成熟恒牙的牙髓成纖維細胞中的VEGF呈陽性表達，向冠部和根部表達逐漸減弱。與年輕恒牙比較，成熟恒牙的牙髓成纖維細胞中的VEGF表達較弱，在冠部和根部的表達較弱，與Matsuzaka等[8]和王青等[9]的研究結(jié)果相似。VEGF表達增強以及在年輕恒牙與成熟恒壓中的表達不同有以下幾方面意義：(1)正畸牙齒移動過程中，骨的改建是基于正畸牙移動，骨改建與血管改建關(guān)系密切，因此這個改建過程促使了牙髓的VEGF陽性表達，正畸牙的VEGF水平增高可促使血管的生成并提供豐富的血供與營養(yǎng)，募集破骨細胞，加快正畸牙移動，縮短正畸療程，因此VEGF水平增高對牙髓修復(fù)具有重要意義[10]；(2)牙髓中VEGF 的表達還涉及多種機制的調(diào)控，如TNF-α、IL-6和TGF-α等多種細胞因子和生長因子，缺氧、機械或理化刺激等可上調(diào)VEGF-mRNA 表達，使 VEGF 釋放到細胞外液，研究顯示正畸過程中，牙周膜受壓變窄，官腔受壓變窄，壓力區(qū)出現(xiàn)缺血缺氧，均導(dǎo)致VEGF表達增高[11-14]；(3)在牙齒發(fā)育的不同階段，恒牙牙髓的VEGF水平不同，VEGF的功能發(fā)揮是通過識別Flt-1 或 Flk-1實現(xiàn)的，與成熟恒牙比，年輕恒牙 VEGF受體Flk-1的表達是成熟恒牙的1倍以上[7]，進一步說明年輕恒牙牙髓組織血管再生潛力高于成熟恒牙。因此增強 VEGF的表達、促進血管再生、誘導(dǎo)牙髓完全性修復(fù)牙本質(zhì)的形成對于成熟恒牙的牙髓修復(fù)尤其重要，除了銼激根尖部出現(xiàn)凝血，還可將外源性 VEGF 和相關(guān)受體加入到支架和牙髓細胞的復(fù)合體中，或利用基因技術(shù)，將人 VEGF 及受體基因轉(zhuǎn)入牙髓干細胞或成纖維細胞，使種子細胞持續(xù)產(chǎn)生VEGF 和相關(guān)受體，為修復(fù)性牙本質(zhì)形成提供足夠的血管化并調(diào)節(jié)細胞的活性，從而達到治愈牙髓病的目的[3,12-15]。

關(guān)于牙髓取材的方法，采用劈牙取髓法，固定時間短，牙體無須脫鈣，切片和展片難度低，但該方法取得的牙髓組織有不同程度的破壞，根尖部破壞更明顯，牙髓根尖狹窄部位在剝離時很容易斷裂，鏡下組織撕脫表現(xiàn)明顯，而且劈牙取髓致使部分成牙本質(zhì)細胞殘留在髓腔壁。本研究采用牙體-牙髓聯(lián)合切片法，可克服直接取髓法的的缺點，但有固定時間長、脫鈣成本高和切片難度大等缺點。綜合來看，兩者均有優(yōu)缺點，但從切片結(jié)果解讀方面，牙體-牙髓聯(lián)合切片明顯優(yōu)于直接取髓法，該法較好地保證牙髓組織的完整性，容易區(qū)分牙髓的冠根部和成纖維細胞，更有利于研究VEFG在牙髓組織的客觀表達。

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