古麗米拉·巴依坦， 余 麗， 師曉莉， 張 巍， 苗 娜

(1新疆人口和計劃生育科研所病理科， 烏魯木齊 830011； 2新疆昌吉市第二人民醫(yī)院病理科， 新疆 昌吉 831100；3新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科， 烏魯木齊 830054)

子宮內(nèi)膜非典型增生(endometrial atypical hyperplasia)被認為是子宮內(nèi)膜樣腺癌的前驅(qū)病變[1]，通常經(jīng)歷子宮內(nèi)膜復雜型增生、非典型增生和癌的演變過程。研究顯示DNA錯配修復基因(DNA mismatch repair gene，MMR)系統(tǒng)對人體細胞中遺傳物質(zhì)的完整性和穩(wěn)定性起著極為重要的作用。MMR基因能特異性地識別和修復DNA復制過程中出現(xiàn)的堿基錯配。目前國內(nèi)外有關MMR系蛋白在子宮內(nèi)膜非典型增生中變化的研究較少。本研究對50例子宮內(nèi)膜非典型增生組織中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)狀態(tài)與臨床特征的關系進行分析，探討MSI在子宮內(nèi)膜非典型增生中的表達意義。

1 材料與方法

1.1一般材料隨機收集新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科2006年8月-2013年5月子宮內(nèi)膜非典型增生標本50例，其中全子宮切除術標本9例，子宮內(nèi)膜活檢標本41例。標本均經(jīng)10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋?；颊吣挲g29～71歲，平均年齡45.6歲。組織切片由2名高年資病理醫(yī)師復閱，按照2004年版《女性生殖道病理學》[2]，子宮內(nèi)膜非典型增生病理學診斷標準根據(jù)腺上皮細胞異型、腺體的結(jié)構及間質(zhì)的改變進行形態(tài)學診斷，準確篩選子宮內(nèi)膜非典型病例。另收集正常增生期子宮內(nèi)膜50例標本設為對照組。

1.2子宮內(nèi)膜非典型增生的形態(tài)學診斷標準腺上皮細胞大小不等，復層排列、極向較紊亂；核大，染色質(zhì)粗糙、深染，核仁明顯，核分裂象增多；胞質(zhì)豐富、淡染或嗜酸性。腺體“迷宮”樣排列及背靠背現(xiàn)象。腺體∶間質(zhì)>3∶1；泡沫細胞增多；無異型細胞的浸潤。

1.3實驗試劑單克隆鼠源性抗體， MLH1(1∶80)、PMS2( 1∶40)、MSH2 (1∶100)、 MSH6(1∶200)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4方法采用免疫組化EnVision二步法，病變周圍正常子宮內(nèi)膜、間質(zhì)細胞和淋巴細胞作為內(nèi)對照，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明操作。

1.5結(jié)果判斷標準MMR蛋白正常表達在細胞核和細胞質(zhì)均可著色。陽性診斷標準為細胞核、細胞質(zhì)同時出現(xiàn)棕黃色顆粒，病變區(qū)域細胞核、細胞質(zhì)均無著色可判斷為陰性(失表達)。非腫瘤性的內(nèi)膜間質(zhì)及淋巴細胞核陽性作為內(nèi)對照。MSI結(jié)果判定標準：錯配修復基因(MMR)中出現(xiàn)2～3個MMR蛋白表達缺失者為高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(high level of microsatellite instability，MSI-H)，只有1個 MMR蛋白表達缺失者為低頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 (Low level of microsatellite instability，MSI-L)，4個MMR均為陽性者為微衛(wèi)星穩(wěn)定性(microsatellite stability，MSS)。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學分析，MMR系蛋白在各組間表達的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1兩組MMR系中MLH1、MSH2、PMS2、MSH6蛋白失表達情況MLH1、MSH2、PMS2和MSH6蛋白在子宮內(nèi)膜非典型增生組織中失表達率分別為12%(6/50)、14%(7/50)、 12%(6/50)、 8%(4/50)。MSH2在50例正常增生期子宮內(nèi)膜組中失表達率為8%(4/50)，其他3種蛋白均無出現(xiàn)失表達。MLH1、PMS2、MSH6在子宮內(nèi)膜非典型增生中失表達率高于正常增生期子宮內(nèi)膜，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組MSH2表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.338)(表1、圖1)。

2.2兩組MSI(MSI-H、MSI-L)與MSS表型子宮內(nèi)膜非典型增生組MMR蛋白失表達所致的MSI-H表型7例(14%)，MSI-L表型9例(18%)，MSS表型34例(68%)，與正常增生期子宮內(nèi)膜組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.005)(表2)。

2.3子宮內(nèi)膜非典型增生組織中MSI(MSI-H、MSI-L)表型與患者年齡的關系年齡≤50歲和>50歲子宮內(nèi)膜非典型增生患者中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.001)(表3)。

a: MLH1蛋白在宮內(nèi)膜非典型增生組織腺上皮細胞核陰性表達

b: MSH6蛋白在增生期子宮內(nèi)膜組織腺上皮細胞核呈棕黃色陽性表達

表1 兩組MMR蛋白的表達情況/例(%)

表2 兩組MSI(MSI-H、MSI-L)和MSS狀態(tài)/例(%)

表3 子宮內(nèi)膜非典型增生病變中的MSI(MSI-H、MSI-L)和MSS狀態(tài)與年齡的關系/例

3 討論

MMR系統(tǒng)最初于大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，迄今為止已分離鑒定9種人類同源MMR基因，其中能參與MMR作用或識別錯配堿基及新生DNA鏈的基因組主要為MLH1、MSH2、PMS2和MSH6，該MMR系在維持基因穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。細胞正常復制過程中DNA靠A-T、 G-C之間的氫鍵互補配對來維持螺旋結(jié)構，而MMR(MLH1、MSH2、PMS2、MSH6)系主要是能識別和修復DNA復制中的錯配堿基，降低基因突變，保證遺傳保守性和穩(wěn)定性。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是癌基因和抑癌基因之后，腫瘤分子發(fā)病機制的又一重大進展，是一種腫瘤形成的機制[3]。一般表現(xiàn)為編碼區(qū)基因突變或蛋白失表達，失去對損傷進行修復功能。有關腫瘤發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，MSI表型腫瘤中頻繁出現(xiàn)MMR基因突變或功能蛋白缺失，MSI檢測已經(jīng)成為篩選錯配修復基因突變腫瘤的一種重要方法，MMR基因喪失錯配修復功能時DNA復制過程中出現(xiàn)的堿基錯配和缺失不能被修復，表現(xiàn)為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(high level of microsatellite instability，MSI-H)[4]。另外有研究顯示，結(jié)直腸癌等腫瘤中MSI-H表型的生物學行為及預后等與MSS/MSI-L表型腫瘤存在顯著差別[5-6]。當前研究普遍認為子宮內(nèi)膜癌是由正常子宮內(nèi)膜復雜型增生至非典型增生病變逐步發(fā)展而來的。不典型增生婦女若不經(jīng)治療則有20%～52%的病例可發(fā)展為子宮內(nèi)膜癌[1]。子宮內(nèi)膜在各種刺激因素作用下增生活躍時，組織中DNA復制頻繁，堿基錯配率增多，功能區(qū)MMR基因突變導致蛋白缺陷。

Wang等[7]的動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，PTEN(屬于抑癌基因，位于10q23.3)突變的子宮內(nèi)膜不典型增生小鼠如果合并MLH1突變，短時間內(nèi)發(fā)生癌變，表明錯配修復基因MLH1突變可以促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。本研究顯示，MMR(MLH1、MSH2、PMS2、MSH6)蛋白在子宮內(nèi)膜非典型增生組織中的失表達率分別為12%(6/50)、14%(7/50)、12%(6/50)、8%(4/50)；MSH2在正常增生期子宮內(nèi)膜組織中失表達率為 8%(4/50)；MLH1、PMS2、MSH6在子宮內(nèi)膜非典型增生組的失表達率顯著高于正常增生期子宮內(nèi)膜組(P<0.05)，而兩組MSH2的失表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.338)，提示非典型增生病變有惡變的傾向；MMR蛋白在正常的子宮內(nèi)膜中具有修復錯配堿基的作用，而非典型增生組織中有不同程度的蛋白失表達，表明在子宮內(nèi)膜異常增生時MMR蛋白缺失引起錯配修復功能的降低或喪失，增加腫瘤易感性[8]。

Sherman等[9]研究表明，子宮內(nèi)膜非典型增生和子宮內(nèi)膜樣腺癌具有相似的分子生物學改變。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)出現(xiàn)于28%的非典型增生病變和子宮內(nèi)膜樣腺癌中。本研究通過4種蛋白失表達率檢測非典型增生子宮內(nèi)膜組織中的 MSI表型為32%(16/50)，略高于文獻[9]報道結(jié)果,其中子宮內(nèi)膜非典型增生組MSI-H(7/50)、MSI-L(9/50)表型高于正常增生期子宮內(nèi)膜組MSL-L(4/50)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005)。有關子宮內(nèi)膜癌前病變的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性研究顯示， MSI表型的內(nèi)膜腺癌組織周圍的非典型增生病變也為MSI表型，子宮內(nèi)膜腺癌和內(nèi)膜非典型增生病變屬于同一譜系[10]，MSI表型內(nèi)膜非典型增生性病變更易通過連續(xù)的克隆性變化發(fā)展為癌。

發(fā)病年齡是腫瘤研究中的重要因素，因而癌前病變發(fā)展為癌之前，通過對高危年齡組人群進行基因檢測篩選MMR基因突變者，可實現(xiàn)腫瘤相關的預防措施及早期診斷[11]。研究顯示，子宮內(nèi)膜非典型增生患者平均年齡為(50±11)歲[12]，多處于圍絕經(jīng)期。本組患者平均年齡為45.6歲。本研究進一步分析了微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與內(nèi)膜非典型增生患者年齡的關系，年齡≤50歲者MSI-H和MSS表型高于年齡>50歲者，相反，>50歲者MSI-L表型高于≤50歲者，但差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.001) 。目前認為MSI-H是一個獨立群體[13]，在低分化腫瘤中的比率高，并且預后差。本研究結(jié)果驗證了在子宮內(nèi)膜非典型增生中所檢測到的MSI-H與患者年齡的相關性。但目前研究對MSI-L的所占比例和其特點還不是很清楚，主要是對MSI-L的定義尚不是很明確，在研究中對MSI-L判定標準差異很大，因此有待于進一步研究。

綜上所述，MMR蛋白失表達及MSI(MSI-H)可能是子宮內(nèi)膜非典型增生的分子事件，了解MSI-H表型在子宮內(nèi)膜非典型增生中的表達及意義，可為病變的預防與早期診斷提供更多信息。

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