趙雅寧，劉文倩，牛 靜，李建民，李淑杏，陳長香

(河北聯(lián)合大學：1. 護理與康復學院；2.附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山 063000)

◇中醫(yī)藥研究◇

參芎化瘀膠囊通過VEGF/Notch1信號通路改善大鼠缺血性腦卒中損傷

趙雅寧1，劉文倩1，牛 靜1，李建民2，李淑杏1，陳長香1

(河北聯(lián)合大學：1. 護理與康復學院；2.附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山 063000)

目的 探討參芎化瘀膠囊對全腦缺血再灌注損傷大鼠的治療作用及對海馬區(qū)VEGF/Notch1通路的影響。方法 SD大鼠分為假手術組、模型組及參芎化瘀膠囊高、低劑量組。采用改良的Pulsineli 4血管阻斷(4-VO)法制作全腦缺血模型，分別在缺血24、48、72 h應用光鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)的變化；應用免疫組化法檢測海馬區(qū)VEGF、Notch1表達。結(jié)果 與假手術組比較，模型組海馬區(qū)各時間點的存活神經(jīng)細胞率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；VEGF、Notch1表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，參芎化瘀膠囊組各時間點的存活神經(jīng)細胞率增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；VEGF、Notch1表達進一步升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述變化在高劑量參芎化瘀膠囊組更為明顯。模型組VEGF與Notch1表達呈正相關(r=0.846，P<0.01)；參芎化瘀膠囊組VEGF與Notch1表達呈正相關(r=0.814，P<0.01)。結(jié)論 參芎化瘀膠囊對腦缺血損傷有很好的治療作用，其機制可能與調(diào)控VEGF/Notch1信號途徑有關。

參芎化瘀膠囊；腦缺血再灌注；血管內(nèi)皮生長因子；Notch1

參芎化瘀膠囊是由人參、地鱉蟲、川芎、乳香(制)、沒藥(制)、全蝎、紫河車、龍血竭、五味子、石菖蒲、郁金、桑葚子等多種成分組成的復方制劑，具有養(yǎng)血益氣、化瘀通絡等作用。藥理學研究顯示，川芎、郁金、人參皂甙等提純物或活性成分具有抑制白細胞浸潤、減輕缺血腦組織炎癥反應、抗自由基、阻止鈣離子內(nèi)流、抑制腦缺血導致的神經(jīng)細胞凋亡等作用。我們前期的研究也顯示，參芎化瘀膠囊對腦缺血再灌注后腦組織內(nèi)信號通路，如MAPKs、PI3K信號通路有調(diào)節(jié)作用[1-4]。血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)不僅能促進血管的生成，同時對腦缺血缺氧損傷具有直接的神經(jīng)保護作用，且可促進神經(jīng)細胞新生[5]。Notch表達于多種組織和器官中，可調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡?，F(xiàn)已證實，哺乳動物體內(nèi)Notch1受體可以在成人大腦中的海馬區(qū)域表達，影響海馬神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)可塑性[6]。本研究建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型，應用不同劑量參芎化瘀膠囊進行干預，觀察海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構，從VEGF/Notch1通路角度探討參芎化瘀膠囊對缺血性腦卒中的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠69只，體質(zhì)量200～250 g，于河北聯(lián)合大學動物實驗室喂養(yǎng)。實驗室環(huán)境：溫度22～26 ℃，相對濕度40%～70%，空氣壓力梯度維持20 Pa。實驗室每天上、下午進行紫外線消毒各1次，每次20 min，每周進行1次徹底消毒。大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后進行動物模型制作。飼養(yǎng)期間大鼠飲食及其他情況正常，未出現(xiàn)意外傷害及死亡情況。

1.2 藥品、試劑及儀器 參芎化瘀膠囊(Shen xiong hua yu capsule)：主要由人參、川芎、地鱉蟲、沒藥(制)、乳香(制)、全蝎等多種中藥成分組成的復方制劑，由河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院研制，批號為Z20051586，規(guī)格為每粒裝0.4 g，實驗時用蒸餾水配置成藥液(質(zhì)量濃度為48 mg/mL)備用。Notch1鼠單克隆抗體和SABC顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；日本Olympus Ixto顯微鏡；德國Kontron IBAS 2.0全自動圖像分析系統(tǒng)，由河北聯(lián)合大學形態(tài)學實驗室提供。

1.3 動物分組 實驗動物分為3組：假手術組(15只)、腦缺血30 min/再灌注組(模型組，18只)、腦缺血30 min/再灌注+參芎化瘀膠囊組(24 mg/100 g，18只)，腦缺血30 min/再灌注+參芎化瘀膠囊組(48 mg/100 g，18只)。藥物組造模前10 d及造模期間灌胃給藥，術后24、48、72 h取材。手術過程中模型組和2個給藥組各死亡3只，最終各組有15只動物納入統(tǒng)計。

1.4 模型制備 采用改良的Pulsineli 4血管阻斷(4-VO)法[7]制作SD大鼠全腦缺血模型：動物常規(guī)麻醉，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，在其下置線備用。枕后部正中切開，暴露雙側(cè)第1頸椎橫突翼孔，直視下熱凝其下通過的椎動脈，電凝每次時間約2～4 s，使翼小孔后雙側(cè)椎動脈永久閉塞。術后大鼠縫皮回籠，24 h后以無創(chuàng)性微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，腦電檢測缺血后呈一條直線、大鼠在缺血開始30～60 s內(nèi)昏迷、翻正反射消失、雙側(cè)瞳孔放大為造模成功。缺血30 min后松開動脈夾，實行再灌注。假手術組分離暴露血管，但不電凝椎動脈、不夾閉頸總動脈。

1.5 給藥方法 假手術組、模型組給予生理鹽水10 mL/(kg·d)，參芎化瘀膠囊組(用藥組)給予參芎化瘀膠囊藥液240 mg/(kg·d)和480 mg/(kg·d)，每天上午9點灌胃給藥1次，連續(xù)10 d。第10天給藥1 h 后，100 g/L水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，制作腦缺血再灌注模型，術后繼續(xù)給藥至相應時間點后處死。

1.6 病理形態(tài)學觀察 每組取5只大鼠，相應時間點斷頭取腦，視交叉后1～6 mm處冠狀面切開，中間塊入40 g/L多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，片厚5 μm。切片經(jīng)脫蠟脫水后進行HE染色，光學顯微鏡下觀察腦組織的病理變化。存活神經(jīng)細胞密度定量分析：每個標本取5張切片，在有測微尺的光學顯微鏡(×200)下觀察海馬區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)變化(有明顯細胞膜、細胞核、核仁為存活神經(jīng)細胞)。具體方法：將海馬區(qū)平均分為5個等份，每個等份選取一個相同部位，應用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)分別計數(shù)其中每個視野(×200)下存活神經(jīng)元的數(shù)量及總細胞數(shù)量，以每個視野下平均存活細胞百分率[活細胞數(shù)量與總細胞數(shù)量比值(%)]表示。

1.7 VEGF和Notch1蛋白的免疫組化染色 切片常規(guī)脫蠟后置于枸櫞酸鹽微波修復，分別滴加VEGF(1∶150)和Notch1(1∶200)，濕盒中4 ℃過夜，IgG抗體-HRP多聚體(PV二步法)，37 ℃溫箱30 min，DAB顯色，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片，陽性率的定量分析：每個標本取4張切片，400倍光鏡下每張切片在海馬隨機選取4個視野，在有測微尺的光學顯微鏡(×200)下觀察海馬區(qū)陽性細胞變化并計數(shù)陽性細胞數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織的病理改變 假手術組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞結(jié)構正常、排列整齊，細胞核清晰，核仁明顯。模型組大鼠腦缺血再灌注24 h，海馬區(qū)可見較多腫脹的神經(jīng)元，間質(zhì)水腫，結(jié)構疏松，神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞出現(xiàn)核固縮、深染，也有部分神經(jīng)元胞核完全消失，形成空泡狀結(jié)構；缺血再灌注48 h，腦組織神經(jīng)細胞嚴重破壞，可見較多變性壞死的神經(jīng)細胞，神經(jīng)細胞呈空泡狀或海綿狀，出現(xiàn)核固縮、碎裂和核仁消失現(xiàn)象，間質(zhì)水腫明顯；缺血再灌注72 h，模型組可見壞死神經(jīng)細胞，腦組織結(jié)構破壞，結(jié)構疏松，核膜碎裂、核仁消失。與對照組比較，各時間點存活神經(jīng)細胞率降低(P<0.05)。參芎化瘀膠囊組各時間點海馬區(qū)受損神經(jīng)元組織學變化均較模型組同時間點減輕，相對正常神經(jīng)細胞占大多數(shù)，存活神經(jīng)細胞率增高(P<0.05，表1)。上述變化在高劑量組中更為明顯(圖1)。

表1 各組大鼠海馬區(qū)存活神經(jīng)細胞率的比較

Tab.1 Comparison of the survival rate of nerve cells in the hippocampus of each group (%/visual field, ±s)

與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

圖1 各組大鼠術后72 h海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的變化

Fig.1 Morphological changes in the hippocampal region in each group at 72 h after surgery (HE, ×400)

A：假手術組；B：模型組；C：參芎化瘀膠囊低劑量組；D：參芎化瘀膠囊高劑量組。

2.2 VEGF和Notch1蛋白的表達情況 VEGF免疫組化染色呈棕黃色，定位于細胞質(zhì)中。與假手術組比較，模型組相應時間點的VEGF表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。參芎化瘀膠囊組與相應時間點的模型組比較，VEGF表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述變化在高劑量組中更為明顯(P<0.05，圖2，表2)。Notch1免疫組化染色呈棕黃色，定位于細胞胞質(zhì)中。與假手術組比較，模型組相應時間點的Notch1表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。參芎化瘀膠囊組與相應時間點的模型組比較，Notch1表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述變化在高劑量組中更為明顯(P<0.05，表3、圖3)。

圖2 各組大鼠術后72 h海馬區(qū)VEGF1的表達情況

Fig.2 Expression of VEGF in the hippocampal region of each group by immunohistochemistry (×400)

A：假手術組；B：模型組；C：參芎化瘀膠囊低劑量組；D：參芎化瘀膠囊高劑量組。

表2 各組大鼠海馬區(qū)VEGF陽性神經(jīng)細胞數(shù)量的比較

Tab.2 Comparison of the VEGF positive nerve cells in the hippocampus of each group (number/visual field, ±s)

與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

表3 各組大鼠海馬區(qū)Notch1陽性神經(jīng)細胞數(shù)量的比較

Tab.3 Comparison of the Notch1 positive nerve cells in the hippocampus of each group (number/visual field, ±s)

與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05。

圖3 各組大鼠術后72 h海馬區(qū)Notch1的表達情況

Fig.3 Expression of Notch1 in the hippocampal region of each group by immunohistochemistry (×400)

A：假手術組；B：模型組；C：參芎化瘀膠囊低劑量組；D：參芎化瘀膠囊高劑量組。

2.3 VEGF和Notch1表達的相關分析結(jié)果 相關分析顯示，模型組VEGF與Notch1呈正相關(r=0.846，P<0.01)；低參芎化瘀膠囊組VEGF與Notch1呈正相關(r=0.789，P<0.01)；高參芎化瘀膠囊組VEGF與Notch1呈正相關(r=0.814，P<0.01)。

3 討 論

VEGF是一種內(nèi)皮細胞特異的有絲分裂原。研究顯示，腦缺血損傷病理環(huán)境中VEGF表達增多，外源性靜脈注入VEGF以及皮質(zhì)表面局部使用VEGF可減少短暫性局灶性腦缺血大鼠的缺血性腦損害[5]。陳懿等[8]應用腦泰方提取物對局灶性腦缺血動物進行干預，顯示梗死灶周圍VEGF陽性細胞及VEGF mRNA表達增多，動物神經(jīng)運動功能損傷癥狀減輕。VEGF的神經(jīng)保護機制：①促進微血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移，促使血管生成，改善局部血供，減少梗死體積，而減輕缺血性腦損傷；②直接營養(yǎng)神經(jīng)細胞，促進神經(jīng)細胞存活；③調(diào)控某些信號，如PI3K/Akt/NF-kB信號通路途徑來抑制神經(jīng)細胞凋亡；④促進神經(jīng)發(fā)生和新神經(jīng)元的存活，提高腦修復[9-11]。本研究結(jié)果顯示，參芎化瘀膠囊干預組VEGF陽性細胞較模型組進一步增加，且在高劑量組表現(xiàn)更為明顯。說明芎化瘀膠囊可增強腦缺血后VEGF活化效應，與前期的研究結(jié)果一致[12]。提示芎化瘀膠囊的腦保護作用與提高腦缺血后VEGF表達有關。

哺乳動物體內(nèi)的Notch家族有4種受體：Nocth1、Notch2、Notch3和Notch4，是由Notch基因編碼，約300 ku的單跨膜蛋白。目前，已證實中樞神經(jīng)系統(tǒng)中能檢測到Notch蛋白及其通路的基因蛋白。研究認為，腦缺血損傷后激活的Notch1通過作用于Akt，PI3-K/PKB/Akt信號通路，從而促進腦缺血損傷后神經(jīng)細胞的存活[13]。此外，研究顯示，Notch1參與缺血腦損傷后血管及神經(jīng)元的新生過程[14-15]。有學者[16]采用高壓氧預處理可以激活Notch信號通路，使其在24 h開始表達，72 h達到高峰，能有效減輕腦梗死后神經(jīng)功能損傷和梗死面積。國內(nèi)楊云霞等[17]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦梗死后補充葉酸可以增加腦缺血后Notch1的表達，同時降低梗死體積、減輕腦梗所造成的神經(jīng)細胞損傷。在本研究中，與假手術組比較，模型組中海馬區(qū)Notch1陽性細胞增加，而參芎化瘀膠囊干預組中Notch1陽性細胞進一步增加，且在高劑量組表現(xiàn)更為明顯，說明芎化瘀膠囊可增強腦缺血后Notch1的表達而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。我們發(fā)現(xiàn)，腦缺血后VEGF表達與Nocth1呈正相關，同時參芎化瘀膠囊可呈劑量依賴式調(diào)節(jié)二者變化，結(jié)合高低劑量參芎化瘀膠囊對腦缺血后神經(jīng)細胞存活率的變化，我們認為參芎化瘀膠囊通過調(diào)控VEGF/Notch1信號通路改善大鼠缺血性腦卒中損傷。研究認為，組織缺血缺氧誘導VEGF等生長因子表達，可以誘導細胞受體Notch1表達，促進并調(diào)控局部血管的新生[18]。

綜合本研究的結(jié)果，我們認為參芎化瘀膠囊通過調(diào)節(jié)并穩(wěn)定腦缺血的微環(huán)境，強化腦缺血后VEGF活化效應，進而啟動Notch1活化，促進缺血部位血管生成，從而減少再灌注后的神經(jīng)細胞死亡。

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(編輯 卓選鵬)

Shenxiong Huayu capsule attenuates cerebral ischemia injuryby regulating VEGF/Notch1 signal pathway in rats

ZHAO Ya-ning1, LIU Wen-qian1, NIU Jing1, LI Jian-min2,LI Shu-xing1, CHEN Chang-xiang1

(1. Nursing and Rehabilitation College, Hebei United University; 2. Department of Neurosurgery,the Affiliated Hospital of Hebei United University, Tangshan 063000, China)

Objective To investigate the effects of Shenxiong Huayu capsules in treating cerebral ischemia-reperfusion and on vascular endothelial growth factor (VEGF)/Notch1 signal pathway. Methods Male SD rats were divided randomly into four groups: sham operation group, model group, and Shenxiong Huayu capsule low-dose and high-dose treatment groups. Global cerebral ischemia model was created by improved four-vessel occlusion as described according to Pulsinelli’s method. Morphological changes in the hippocampal region were observed by HE staining at 24 h, 48 h and 72 h after ischemia; VEGF and Notch1 expressions were measured by immunohistochemistry. Results Compared with those in sham group, the survival rate of nerve cells decreased significantly at each time point (P<0.05) and VEGF and Notch1 expressions enhanced obviously in model group (P<0.05). Compared with model group, the survival rate of nerve cells increased obviously at each time point and VEGF and Notch1 expressions further increased in the two Shenxiong Huayu capsule groups (P<0.05). The above-mentioned changes were more significant in Shenxiong Huayu capsule high-dose group. VEGF and Notch1 expressions had a positive correlation with each other in model group (r=0.846,P<0.01) and Shenxiong Huayu capsule groups (r=0.814,P<0.01). Conclusion Shenxiong Huayu capsules have a good therapeutic effect on cerebral ischemia injury and the molecular mechanism is related to regulating VEGF/Notch1 signal pathway.

Shenxiong Huayu capsule; cerebral ischemia-reperfusion; vascular endothelial growth factor (VEGF); Notch1

2013-10-24

2014-03-26

河北省科技廳課題基金(No.H2012401007) Supported by Hebei Science and Technology Department Research Fund (No.H2012401007)

李建民，教授. E-mail: lijianmints@sina.com

趙雅寧(1974-)，女(漢族)，醫(yī)學博士. 研究方向：腦損傷與腦保護. E-mail: zyning789@126.com

時間：2014-05-16 14∶50 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140918.1003.006.html

R743

A

10.7652/jdyxb201406023