石秀彩,信栓力,孔令恩,宋新星,王利民,史文俊
? 論著 ?
參芎葡萄糖注射液對(duì)兔頸動(dòng)脈球囊損傷后血管內(nèi)膜增生的影響
石秀彩1,信栓力2,孔令恩1,宋新星1,王利民3,史文俊4
目的 觀察參芎葡萄糖注射液對(duì)兔頸動(dòng)脈球囊損傷后血管內(nèi)膜增生的影響。方法 選取4月齡健康雄性新西蘭兔35只,隨機(jī)分為空白組、手術(shù)組、辛伐他汀組、參芎葡萄糖組、參芎葡萄糖+辛伐他汀組,每組7只。飼養(yǎng)2周后測(cè)定血清膽固醇水平,蘇木精-伊紅染色法(HE)觀察血管內(nèi)膜增生情況,免疫組織化學(xué)染色分析血管內(nèi)膜中膜增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá),Western blot法分析頸動(dòng)脈葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)表達(dá)。結(jié)果 與空白組相比,手術(shù)組血清膽固醇水平無(wú)明顯區(qū)別。與空白組、手術(shù)組、參芎葡萄糖組相比,辛伐他汀組血清膽固醇水平降低(P<0.05)。與空白組、手術(shù)組相比,參芎葡萄糖組血清膽固醇水平降低(P>0.05)。參芎葡萄糖+辛伐他汀組血清膽固醇水平低于辛伐他汀組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。HE染色結(jié)果表明手術(shù)組血管內(nèi)膜較空白組增厚(P <0.05),參芎葡萄糖組血管內(nèi)膜增生較手術(shù)組及辛伐他汀組減少(P<0.05),參芎葡萄糖+辛伐他汀組血管內(nèi)膜增生較參芎葡萄糖組減少,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明參芎葡萄糖組內(nèi)膜中膜PCNA、MMP9陽(yáng)性細(xì)胞率較手術(shù)組均降低(P<0.05),參芎葡萄糖組MMP9、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞率較辛伐他汀組均降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),參芎葡萄糖+辛伐他汀組MMP9、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞率較參芎葡萄糖組降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Western blot結(jié)果表明參芎葡萄糖組GRP78表達(dá)量較手術(shù)組、辛伐他汀組均降低(P<0.05)。結(jié)論 參芎葡萄糖注射液可有效減緩球囊損傷后血管內(nèi)膜增生。
參芎葡萄糖注射液;球囊損傷;血管內(nèi)膜增生
1.1實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性新西蘭兔44只(由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),3月齡,體重2.0~2.5 kg,健康,所選動(dòng)物符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格標(biāo)準(zhǔn)。
1.1.2主要材料 血管內(nèi)膜中膜增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體(Abcom,美國(guó));基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體(Abcom,美國(guó));葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)抗體(Abcom,美國(guó));PCNA檢測(cè)試劑盒(中杉金橋,中國(guó)),MMP-9抗體免疫組化試劑盒(中杉金橋,中國(guó))。參芎葡萄糖注射液(貴州景峰注射劑有限公司)。
1.2方法
1.2.1建立動(dòng)物模型 挑選健康新西蘭兔,雄性,35只,隨機(jī)分為5組,每組7只:空白組,僅給予高脂飲食(93%普通飼料+2%膽固醇+5%豬油),無(wú)球囊損傷,無(wú)藥物干預(yù);手術(shù)組,給予球囊損傷(圖1),并高脂飲食;辛伐他汀組,給予球囊損傷+高脂飲食+辛伐他汀片2.2 mg/ (kg·d)口服;參芎葡萄糖組,給予球囊損傷+高脂飲食+參芎葡萄糖注射液5 ml/(kg·d)腹腔內(nèi)注射;
參芎葡萄糖+辛伐他汀組,給予球囊損傷+高脂飲食+參芎葡萄糖注射液5 ml/(kg·d)腹腔內(nèi)注射+辛伐他汀片2.2 mg/(kg·d)口服。以上實(shí)驗(yàn)兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,空白組對(duì)照不做處理,僅高脂喂養(yǎng)2周;其余各組行球囊損傷,后高脂飲食喂養(yǎng)2周。實(shí)驗(yàn)兔自由飲水,進(jìn)食量120~150 g/d。
1.2.2實(shí)驗(yàn)取材 處死前于兔耳緣靜脈取血2 ml,2500 r/min離心后取上清,于全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清膽固醇水平。取血后氣體栓塞處死兔子,立即切開頸部,分離并離斷球囊損傷處右側(cè)頸總動(dòng)脈(約0.6 cm),生理鹽水沖洗后,每段血管均分為2段,一段放入1.5 ml EP管中,立即放入液氮冷凍,另一段在福爾馬林液中固定24 h后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋。
1.2.3觀察血管內(nèi)膜增生情況 對(duì)石蠟進(jìn)行常規(guī)切片病理進(jìn)行HE染色,于OLYMPUS光學(xué)顯微鏡下觀察血管內(nèi)膜(圖1)。
圖1 球囊損傷術(shù)后7 d、14 d、21 d血管內(nèi)膜增生情況[A:7 d,B:14 d,C:21 d;(HE染色,×40)]
1.2.4免疫組織化學(xué)法測(cè)定PCNA、MMP9表達(dá)水平 石蠟切片,片厚5μm,按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作,用OLYMPUS光學(xué)顯微鏡,隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)高倍鏡(×400)視野對(duì)PCNA、MMP9陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。
1.2.5Western blot法測(cè)定GRP78表達(dá)水平 取血管組織于勻漿器中,加入RIPA裂解液400 ul,冰上手動(dòng)勻漿,直至無(wú)肉眼可見組織塊,然后超聲破碎,每管10 s×3次,冰上操作,12000 r/min,4 ℃,離心10 min,取上清,BCA蛋白定量法測(cè)量蛋白濃度,余上清煮沸后分裝,配置10%分離膠及5%濃縮膠,每孔上樣100 μg蛋白樣品,marker上樣3 μl,濃縮膠60 V,30 min,分離膠120 V,60 min電泳,隨后半干轉(zhuǎn)的方法(20 V,50 min)將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜,以5%脫脂奶粉封閉1 h后,并用新鮮配制的 TBST洗膜,每次5 min,洗3次,隨后將 NC 膜分別與鼠抗兔 GRP78 抗體(1:1000,Abcam)和鼠抗兔β-actin 抗體(1:1000,Abcam )條件下孵育過夜。用 TBST 洗膜3次,每次5 min,使用羊抗鼠二抗(1:3000)室溫孵育NC膜2 h,配置發(fā)光液,均勻滴在NC膜上,凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描分析。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0完成統(tǒng)計(jì),計(jì)量數(shù)據(jù)以(±s)表示,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析,組間比較用SNK法作q檢驗(yàn),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1頸總動(dòng)脈球囊損傷對(duì)新西蘭兔頸動(dòng)脈內(nèi)膜的影響 石蠟包埋并切片及HE染色后,光鏡下觀察,空白組頸總動(dòng)脈管壁光滑、完整,內(nèi)膜、中膜界限清晰,未見明顯內(nèi)膜增生(圖2A)。手術(shù)組則可見大量的新生內(nèi)膜(圖2B),辛伐他汀組、參芎葡萄糖組及參芎葡萄糖+辛伐他汀組內(nèi)膜增生情況較手術(shù)組明顯降低(圖2C、D、E)。手術(shù)組的內(nèi)膜面積(NIA)和中膜面積(MIA)比值較空白組顯著增加(P<0.05),而辛伐他汀組、參芎葡萄糖組及參芎葡萄糖+辛伐他汀組NIA/MIA小于手術(shù)組NIA/MIA(P <0.05),其中,參芎葡萄糖組NIA/MIA小于辛伐他汀組NIA/MIA(P<0.05),參芎葡萄糖+辛伐他汀組NIA/MIA小于參芎葡萄糖組NIA/MIA,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。
2.2新西蘭兔血清中血清膽固醇水平的比較 從兔耳緣靜脈抽血后,于生化分析儀上測(cè)定血清中血清膽固醇水平,結(jié)果顯示,空白組與手術(shù)組兩者間血清膽固醇水平無(wú)明顯區(qū)別,辛伐他汀組血清膽固醇水平明顯低于參芎葡萄糖組及空白組與手術(shù)組(P<0.05),參芎葡萄糖組的血清膽固醇水平低于空白組及手術(shù)組,但這兩者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。參芎葡萄糖+辛伐他汀組血清膽固醇水平低于辛伐他汀組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖3)。
圖2 藥物干預(yù)后血管內(nèi)膜增生情況[A:空白組;B:手術(shù)組;C:辛伐他汀組;D:參芎葡萄糖組;E:參芎葡萄糖+辛伐他汀組(HE染色,×200)]
2.3新西蘭兔頸動(dòng)脈內(nèi)膜中PCNA及MMP-9的表達(dá)變化 光鏡下觀察,PCNA、MMP9免疫組化陽(yáng)性的細(xì)胞為棕色,空白組中陽(yáng)性細(xì)胞少,而手術(shù)組、辛伐他汀組、參芎葡萄糖組則可見血管內(nèi)膜、中膜上有大量陽(yáng)性細(xì)胞(圖4、5),參芎葡萄糖組與手術(shù)組相比,陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少(P <0.05)。參芎葡萄糖組MMP9及PCNA表達(dá)率低于辛伐他汀組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。參芎葡萄糖+辛伐他汀組MMP9及PCNA表達(dá)率低于參芎葡萄糖組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。
2.4新西蘭兔頸動(dòng)脈中GRP78表達(dá)變化 提取血管組織蛋白,通過Western blot法觀察GRP78表達(dá)水平(圖6、7)。結(jié)果表明:參芎葡萄糖組GRP78表達(dá)水平明顯低于手術(shù)組及辛伐他汀組(P<0.05)。參芎葡萄糖+辛伐他汀組GRP78表達(dá)水平與參芎葡萄糖組相比無(wú)明顯區(qū)別,參芎葡萄糖+辛伐他汀組GRP78表達(dá)水平明顯低于辛伐他汀組(P<0.05)。
血管內(nèi)膜增生機(jī)制非常復(fù)雜,目前研究認(rèn)為損傷、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)向內(nèi)膜遷移、增殖等多種因素均參與了血管內(nèi)膜增生。近年來,從中藥中尋找抗血管內(nèi)膜增生及探討可能的機(jī)制已成為這一研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)中藥丹參素及川芎嗪具有廣泛的藥理作用。前期研究表明參芎葡萄糖有清除自由基、阻斷脂質(zhì)過氧化、抑制細(xì)胞增殖的作用。本實(shí)驗(yàn)探討參芎葡萄糖對(duì)球囊損傷所致新西蘭兔頸總動(dòng)脈內(nèi)膜增生的抑制效應(yīng)。
本實(shí)驗(yàn)采取高脂喂養(yǎng)新西蘭兔及球囊損傷頸總動(dòng)脈的方法,建立動(dòng)物模型,通過HE染色從組織學(xué)水平觀察球囊損傷后頸總動(dòng)脈內(nèi)膜面積及中膜面積的變化,結(jié)果表明,辛伐他汀及參芎葡萄糖均可減低血管內(nèi)膜的增生,與辛伐他汀相比,參芎葡萄糖可明顯減少血管內(nèi)膜面積的增加,參芎葡萄糖+辛伐他汀聯(lián)合治療同樣可抑制血管內(nèi)膜增生,但與單用參芎葡萄糖相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
脂質(zhì)代謝異常在血管內(nèi)膜增生過程中有重要作用,通過本實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可減低血清中膽固醇及低密度脂蛋白的水平,與不用藥物干預(yù)組、參芎組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。參芎葡萄糖雖然也可以降低血清中膽固醇及低密度脂蛋白水平,但與不用藥物干預(yù)組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。參芎和辛伐他汀聯(lián)合治療可降低實(shí)驗(yàn)兔血清中膽固醇水平,但與單用辛伐他汀相比,無(wú)明顯差別。
表1 各組大鼠間NIA/MIA值、PCNA表達(dá)水平及PMMP-9表達(dá)水平
圖3 各組大鼠血清膽固醇水平(與空白組比較,aP<0.05;與手術(shù)組比較,bP<0.05;與辛伐他汀組比較,cP<0.05;與參芎葡萄糖組比較,dP<0.05)
圖4 PCNA表達(dá)情況(A:空白組;B:手術(shù)組;C:辛伐他汀組;D:參芎葡萄糖組;E:參芎葡萄糖+辛伐他汀組; S-P法,×400 )
圖5 各組間MMP-9表達(dá)水平的免疫組化檢測(cè)(A:空白組;B:手術(shù)組;C:辛伐他汀組;D:參芎葡萄糖組;E:參芎葡萄糖+辛伐他汀組;S-P法,×400)
圖6 GRP78表達(dá)的western blot分析
圖7 GRP78表達(dá)水平(與空白組比較,aP<0.05;與手術(shù)組比較,bP <0.05;與辛伐他汀組比較,cP<0.05)
為了進(jìn)一步探討參芎葡萄糖及辛伐他汀調(diào)控血管內(nèi)膜增生的機(jī)制,通過免疫組化的方法測(cè)定了血管內(nèi)PCNA、MMP9的表達(dá)水平。PCNA僅表達(dá)于增殖過程中的細(xì)胞,表達(dá)的高低與增殖活性相關(guān),通過測(cè)定PCNA表達(dá),可評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)。MMP9可降解細(xì)胞外基質(zhì),為血管平滑肌細(xì)胞穿過基底膜向內(nèi)膜遷移提供條件,促進(jìn)內(nèi)膜新生。本實(shí)驗(yàn)表明,辛伐他汀與參芎葡萄糖均可減低PCNA、MMP9的表達(dá),但兩者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示參芎葡萄糖及辛伐他汀可能通過抑制細(xì)胞增殖及阻礙血管平滑肌遷移調(diào)控內(nèi)膜增生。兩者聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥相比,PCNA、MMP9的表達(dá)的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
本實(shí)驗(yàn)在5 ml/(kg·d)的參芎葡萄糖注射液與2.2 mg/(kg·d)的辛伐他汀給藥的條件下,兩者調(diào)控PCNA、MMP9表達(dá)的能力無(wú)明顯差異,但參芎葡萄糖抑制血管內(nèi)膜增生(H-E染色光鏡下觀察內(nèi)膜面積的明顯差異性)的效果強(qiáng)于辛伐他汀,提示參芎葡萄糖可能通過其他途徑調(diào)控內(nèi)膜增生。
近年來內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)為研究熱點(diǎn),眾多生理病理過程中ERS均參與其中,研究表明,抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效改善內(nèi)膜增生導(dǎo)致的血管狹窄,GRP78屬于熱休克蛋白Hsp70亞家族。該亞家族還包括mtHsp70/GRP75和GRP94。BiP/ GRP78是一種鈣離子結(jié)合分子伴侶,主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。GRP78蛋白上調(diào)被認(rèn)為是ERS的重要指標(biāo)。WB結(jié)果提示與辛伐他汀相比,參芎葡萄糖可明顯抑制GRP78的表達(dá)(P<0.05),可明顯抑制GRP78的表達(dá)(P<0.05),因此參芎葡萄糖可明顯抑制高脂飲食條件下新西蘭兔頸動(dòng)脈損傷后血管內(nèi)膜的增生,其主要可能的機(jī)制為抑制ERS調(diào)控血管內(nèi)膜增生。
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本文編輯:蘆潔,田國(guó)祥
Effect of shenxiong glucose injection on intimal hyperplasia of rabbit vascular after carotid artery balloon injury
SHI Xiu-cai*, XIN Shuan-li, KONG Ling-en, SONG Xin-xing, WANG Li-min, SHI Wen-jun.*Department of Cardiology,The PLA 285th hospital, Handan, Hebei, 056002, China.
XIN Shuan-li, E-mail: xinkexuan@163.com
Objective To observe the effect of shenxiong glucose injection on intimal hyperplasia of rabbit vascular after carotid artery balloon injury. Methods 35 four months old healthy male New Zealand rabbits were randomly divided into control group, operation group, simvastatin group, shenxiong glucose group, shenxiong glucose+ simvastatin group. Each group had 7 rabbits. Two weeks after operation and drug intervention, serum cholesterol level were measured. Hematoxylin and eosin staining (HE) was used to observe intimal hyperplasia;immunohistochemical staining was used to analyze intimal proliferation cell nuclear antigen (PCNA) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) expression, Western blot was used to analyze carotid glucose-regulated protein 78 (GRP78) expression. Results There was no different in serum cholesterol levels between operation group and control group. Serum cholesterol levels of simvastatin group was lower than control group, operation group and shenxiong glucose group (P《0.05). Serum cholesterol levels of shenxiong glucose group was lower than control group and operation group (P《0.05). Serum cholesterol levels of shenxiong glucose+ simvastatin group was lower than simvastatin group with no significant difference (P>0.05). HE result showed that intima of operation group was thicker than control group (P《0.05); intima hyperplasia of shenxiong glucose group was reduced than operation group and simvastatin group (P>0.05); intima hyperplasia of shenxiong glucose+ simvastatin group was reduced than shenxiong glucose group with no significant difference (P>0.05). Immunohistochemical analysis results showed that PCNA, MMP9 positive cells in shenxiong glucose group was reduced than operation group (P《0.05); PCNA, MMP9 positive cells in shenxiong glucose group was reduced than simvastatin group with no significant difference (P>0.05);PCNA, MMP9 positive cells in shenxiong glucose+ simvastatin group was reduced than shenxiong glucose group with no significant difference (P>0.05). GRP78 expression in shenxiong glucose group was reduced than operation group and simvastatin group according to result of Western blot (P《0.05). Conclusion The Shenxiong glucose can effectively reduce neointimal hyperplasia after balloon injury.
Shenxiong glucose injection; Balloon endothelial injury; Intimal hyperplasia
R543
A
1674-4055(2016)05-0619-05
1056002 邯鄲,解放軍第285醫(yī)院心內(nèi)科;2056002 邯鄲,邯鄲市第一醫(yī)院心內(nèi)科;3056002 邯鄲,邯鄲叢臺(tái)區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督局;4056002邯鄲,解放軍第285醫(yī)院檢驗(yàn)科
信栓力,E-mail:xinkexuan@163.com
10.3969/j.issn.1674-4055.2016.05.33
目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)廣泛開展了介入手術(shù)治療冠心病及外周血管疾病,但血管成形術(shù)術(shù)后血管再狹窄嚴(yán)重限制了介入治療的遠(yuǎn)期療效。雖然通過置入藥物洗脫支架可有效的降低術(shù)后再狹窄率,但藥物洗脫支架多應(yīng)用于冠狀動(dòng)脈疾病,且其成本高,大大增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。血管再狹窄的特征為血管內(nèi)膜增生,其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,目前大量試驗(yàn)研究表明血管內(nèi)膜新生、血管重塑、內(nèi)皮細(xì)胞激活、血管平滑肌遷徙增殖、血小板聚集、炎癥反應(yīng)與血管內(nèi)膜增生相關(guān)[1-4]。有相關(guān)研究表明內(nèi)膜損傷后,血小板可在局部粘附、聚集,形成血栓并且激活血小板,釋放血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)等血管活性物質(zhì),促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞的增殖[5-8]。參芎葡萄糖注射液為含有丹參素及川芎嗪的輸液劑型,其中丹參素具有一定的降脂作用,可減低外周血管阻力,降低血液中的粘滯度,抑制血小板聚集,川芎嗪是一種重要活性堿,可降低血管外周阻力,研究表明參芎葡萄糖注射液可改善脂質(zhì)代謝,調(diào)節(jié)血液流變性異常,減輕炎癥反應(yīng)等[9]。本研究通過建立高脂飲食及球囊損傷條件下兔頸總動(dòng)脈血管內(nèi)膜增生模型,以參芎葡萄糖注射液為干預(yù),觀察參芎葡萄糖對(duì)兔頸總動(dòng)脈內(nèi)膜增生的影響及探討可能的機(jī)制,為預(yù)防介入術(shù)后血管再狹窄提供新思路。
中國(guó)循證心血管醫(yī)學(xué)雜志2016年5期