楊柏林，王 歡，彭 軍，徐其明，余 超

高壓氧干預(yù)對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后腦組織NF-κB (p50)表達(dá)的影響

楊柏林，王 歡，彭 軍，徐其明，余 超

目的 觀察高壓氧干預(yù)(hyperbaric oxygenation treatment, HBOT)對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)后NF-κB(p50) 表達(dá)的影響，并探討其機(jī)制。方法 將35只SD大鼠完全隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(Con組)5只、創(chuàng)傷組(TBI)15只、高壓氧干預(yù)組(HBOT)15只。采用Allen’s改良法制造大鼠自由落體重型腦損傷模型，Con組僅切開(kāi)頭皮去骨窗，TBI組給予撞擊損傷，HBOT組于創(chuàng)傷后給予高壓氧治療。利用Western-blot法分別于傷后8 h及1、3、5、8 d檢測(cè)腦組織NF-κB的表達(dá)。結(jié)果 與Con組比，TBI組各時(shí)點(diǎn)腦組織NF-κB表達(dá)均升高(P<0.05)，損傷后3 d達(dá)高峰(0.7267±0.0305)，5～8 d仍維持較高水平(0.5567±0.0603)。HBOT組各時(shí)點(diǎn)NF-κB 表達(dá)水平均較TBI組下降(P<0.05)。結(jié)論 高壓氧干預(yù)可以減弱創(chuàng)傷后腦組織NF-κB(p50)表達(dá)，有效抑制炎性反應(yīng)，為重型顱腦損傷治療提供理論基礎(chǔ)。

重型顱腦損傷；高壓氧；大鼠；NF-κB

顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury,TBI)后繼發(fā)性腦損傷是影響腦外傷預(yù)后的重要因素之一。繼發(fā)性腦水腫及腦損傷可進(jìn)一步加重神經(jīng)功能損害，其中炎性反應(yīng)在繼發(fā)性損害中發(fā)揮著重要作用。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)作為誘導(dǎo)炎性反應(yīng)及細(xì)胞存活的重要轉(zhuǎn)錄因子，在腦損傷后表達(dá)增加，通過(guò)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與繼發(fā)性腦損害及神經(jīng)保護(hù)的雙重作用[1,2]。近年來(lái)，高壓氧(hyperbaric oxygen, HBO)已被廣泛應(yīng)用于臨床。研究表明，對(duì)顱腦損傷患者輔以HBO治療時(shí)間窗越早，提高生存率、降低傷殘率，改善認(rèn)知功能及提高療效越顯著[3,4], 但具體作用機(jī)制未完全清楚。本研究通過(guò)觀察損傷腦組織NF-κB的表達(dá)變化及高壓氧干預(yù)后對(duì)其變化的影響，以期為高壓氧治療重型顱腦損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備 兔抗人NF-κB(p50)多克隆抗體，HRP標(biāo)記的二抗，GAPDH內(nèi)參(Santa Cruz公司)，Western-blot制膠試劑盒，ECL顯色液，UVP凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 選擇健康成年雄性SD大鼠35只，體重約280 g。按照完全隨機(jī)分組原則分為假手術(shù)對(duì)照組(Con組)5只、創(chuàng)傷組(TBI組)15只和高壓氧干預(yù)組(HBOT組)15只。Con組：即以假手術(shù)組作為對(duì)照組，僅切開(kāi)頭皮后去除骨窗而不致腦損傷。HBOT組：致重度腦損傷，損傷后1 h內(nèi)給予第1次高壓氧治療，以后每天1次。TBI組：致重度腦損傷，與HBOT組不同之處是高壓氧艙加壓后氣缸內(nèi)用壓縮空氣替代氧氣。TBI、HBOT組大鼠分別于致傷后8 h及1、3、5、8 d斷頭處死，各時(shí)間點(diǎn)分別處死3只；Con組大鼠各時(shí)間點(diǎn)處死1只，取標(biāo)本進(jìn)行Western-blot檢測(cè)NF-κB(p50)蛋白表達(dá)。

1.3 建立大鼠重型腦損傷模型 參照Chu等[5]研究：大鼠麻醉后，頭頂部備皮，局部消毒，固定于立體定向支架上。沿中線切開(kāi)頭皮，矢狀竇右側(cè)1 mm及前囟后方1 mm交界于右頂骨，去除直徑6 mm的骨瓣。撞擊設(shè)備安裝于支架上，通過(guò)從20 cm高處釋放圓柱形硾條(重30 g，直徑4.5 mm)，撞擊矢狀竇右側(cè)4 mm及前囟后4 mm交點(diǎn)處，造成右側(cè)大腦重型損傷。海綿膠止血，縫合頭皮。

1.4 高壓氧治療 HBOT組大鼠致傷后1 h，放入連有給氧裝置的氣缸內(nèi)，將100%的純氧加壓升至2.4 kPa，在該壓力下維持1 h。將一盤(pán)碳酸鈣晶體置入氣缸內(nèi)，用于降低CO2的積聚，使氧濃度在98%以上，CO2在0.03%以下。腦損傷后1 d，HBOT組大鼠再次暴露于100%純氧中1 h，以后1次/d，直至第8天最后一組實(shí)驗(yàn)結(jié)束[6]。TBI組大鼠放于同樣的氣缸內(nèi)，僅呼吸空氣。

1.5 Western-blot實(shí)驗(yàn) 取創(chuàng)傷邊緣3 mm內(nèi)的腦皮質(zhì)(不包含直接損傷區(qū)域)，RIPA裂解液與組織混勻進(jìn)行裂解，4 ℃、12 000 r/min條件下離心組織勻漿20 min，收集上清，Bradford方法測(cè)蛋白濃度，取30 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，經(jīng)電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉30 min，5%脫脂奶粉稀釋的兔抗人NF-κB(p50)抗體(1∶1500稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，次日TBST洗膜3次，5%脫脂奶粉稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1∶3000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，用ECL方法顯色，曝光，用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶，以GAPDH作內(nèi)參，分別計(jì)算各組A值(標(biāo)本灰度值/內(nèi)參灰度值) 。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Microsoft Excel及SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用析因設(shè)計(jì)的方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 大鼠在沖擊致傷后均立即呈現(xiàn)去大腦強(qiáng)直狀態(tài)，重度腦損傷表現(xiàn),腦挫裂傷灶明顯，范圍廣泛，合并有顱腦出血。

2.2 Western blot檢測(cè)分析結(jié)果 不同時(shí)間點(diǎn)各組腦組織NF-κB(p50)蛋白表達(dá)：結(jié)果顯示Con組內(nèi)可見(jiàn)微弱的NF-κB(p50)蛋白條帶，TBI組NF-κB(p50)表達(dá)不同程度地增強(qiáng)，損傷后8 h已見(jiàn)蛋白表達(dá)升高，第3天達(dá)高峰，之后開(kāi)始下降，5～8 d仍維持較高水平；相較于TBI組，NF-κB(p50)在HBOT組各對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)的表達(dá)有所減弱(P<0.05或P<0.01，圖1及表1)。

圖1 大鼠顱腦創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)腦組織NF-κB(p50)蛋白表達(dá)變化

與Con組比較，不同時(shí)間點(diǎn)上TBI組及HBOT組NF-κB表達(dá)均不同程度增加；而在相同時(shí)間點(diǎn)上，HBOT組較TBI組NF-κB表達(dá)減弱。內(nèi)參GAPDH在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)無(wú)差異，可控制蛋白上樣引起的誤差

表1 高壓氧干預(yù)對(duì)大鼠顱腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)上損傷腦組織NF-κB表達(dá)的影響比較

注：與TBI組比較：①P<0.01，②P<0.05；與Con組相比，③P<0.05

3 討 論

核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)是廣泛存在于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子Rel蛋白家族的成員，其中p50和p65兩個(gè)亞單位是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最主要的，可以被誘導(dǎo)的異源二聚體[7]。NF-κB具有多向性轉(zhuǎn)錄激活功能，靜息狀態(tài)下以非活性形式存在于細(xì)胞漿中，當(dāng)受到應(yīng)激性刺激、炎性反應(yīng)細(xì)胞因子和氧自由基等多種活化因素激活后，由胞質(zhì)移位至胞核，與相應(yīng)的靶基因結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，參與應(yīng)激、炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等腦損傷病理生理過(guò)程。

急性重型顱腦損傷患者NF-κB表達(dá)水平明顯升高，說(shuō)明參與了腦水腫形成，并與腦損傷程度密切相關(guān)，可作為腦外傷嚴(yán)重程度及預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)[8]。本研究結(jié)果表明，對(duì)照組NF-κB蛋白條帶灰度值很低，損傷后8 h可見(jiàn)NF-κB的灰度值增大，損傷后1～3 d可發(fā)現(xiàn)NF-κB明顯表達(dá)。由此可知，NF-κB于損傷后的8 h表達(dá)已增加，1～3 d其表達(dá)明顯增強(qiáng)，傷后5～8 d仍呈高表達(dá)狀態(tài)。雖然其具體時(shí)間點(diǎn)上變化與以往報(bào)道稍有不同，可能與標(biāo)本處理時(shí)間點(diǎn)的選擇、檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量、動(dòng)物抗打擊能力等因素有關(guān)，但一定程度上表明NF-κB在腦外傷后繼發(fā)性腦損傷的病理生理過(guò)程中起了重要作用。腦損傷后NF-κB高表達(dá)，可能與突發(fā)致傷應(yīng)激、繼發(fā)炎性反應(yīng)、氧自由基等刺激有關(guān)，通過(guò)激活某些相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化NF-κB的表達(dá)?；罨腘F-κB又可刺激多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放，形成一種彼此相互作用的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步加重腦損傷。研究表明，腦損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活，通過(guò)TLR-4/MyD88/NF-κB信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路，導(dǎo)致?lián)p傷腦組織中促炎因子釋放及神經(jīng)細(xì)胞凋亡[9]，活化的NF-κB增加促炎因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)，生成的TNF-α和IL-1β又反過(guò)來(lái)再刺激NF-κB活性，形成一種正反饋機(jī)制，不斷放大炎癥信號(hào)，在血腦屏障的完整性、腦水腫中發(fā)揮重要作用[10,11]。細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)是一種嗜中性粒細(xì)胞趨化因子，可以調(diào)節(jié)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附性，促進(jìn)白細(xì)胞從毛細(xì)血管后微靜脈向炎性病灶遷移，腦損傷后其水平增加與NF-κB介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄相關(guān)，參與了腦損傷后繼發(fā)性炎性反應(yīng)[11]。腦損傷后神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-κB活性增加，還可誘導(dǎo)促凋亡因子P53、COX-2、Fas配體等產(chǎn)生，經(jīng)凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終激活caspase導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[12]。減弱NF-κB及相關(guān)炎性反應(yīng)因子的表達(dá)，能顯著降低TBI后的炎性反應(yīng)，并改善實(shí)驗(yàn)大鼠的預(yù)后[1]。

高壓氧已被廣泛用于臨床治療重型顱腦損傷，對(duì)患者的認(rèn)知功能、損害神經(jīng)功能的康復(fù)有顯著效果[3]。HBO減輕動(dòng)脈閉塞引起的腦梗死及神經(jīng)功能缺失損害具有劑量相關(guān)性，通過(guò)增加血液循環(huán)中氧濃度，增高損傷腦組織中氧供應(yīng)，改善腦部微循環(huán)，促進(jìn)能量物質(zhì)ATP產(chǎn)生，增強(qiáng)Na+-K+-ATP酶的活性，進(jìn)而減少腦缺血后谷氨酸鹽及氧自由基的積聚通過(guò)抑制炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子生成，減輕或避免腦損傷后繼發(fā)性損害，降低了腦外傷患者病死率及傷殘率[13-15]。長(zhǎng)期重復(fù)的HBO治療能夠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性腦損傷大鼠的髓鞘明顯再生，并恢復(fù)其感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能[16]。最新研究[6,14]具體探討了高壓氧對(duì)大鼠缺血及缺血-再灌注損傷治療的可能機(jī)制：治療劑量下的高壓氧通過(guò)抑制NF-κB、p38及c-JUN激酶等信號(hào)通路的活化，并通過(guò)降低活性氧、酶促氧化物及氮化物水平、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及增高酶促抗氧化物水平來(lái)減輕氧化性損害；通過(guò)降低TNF-α、IL-1β和CD44表達(dá)水平及髓過(guò)氧化物酶活性，抑制炎性反應(yīng)狀態(tài)；再者，HBO可促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子，如IL-10的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。本研究顯示，HBOT組NF-κB蛋白條帶灰度值較TBI組在同時(shí)間段均有明顯降低；然而相較Con組，其水平仍呈一種過(guò)表達(dá)狀態(tài)，說(shuō)明高壓氧干預(yù)對(duì)NF-κB的表達(dá)起到了抑制作用，提示治療劑量HBO可抑制NF-κB的進(jìn)一步活化發(fā)揮其抗損傷作用；但與此同時(shí)腦損傷后維持NF-κB的高表達(dá)，表明機(jī)體可能通過(guò)內(nèi)源性的抗損傷機(jī)制在一定程度上誘導(dǎo)NF-κB的活化來(lái)對(duì)抗所受到的損傷。因此，在關(guān)注腦損傷后活化的NF-κB參與了炎性反應(yīng)致繼發(fā)性損傷的同時(shí)，也必須意識(shí)到NF-κB的過(guò)表達(dá)在一定程度上起到腦保護(hù)的功能。

研究表明，高壓氧干預(yù)后NF-κB(p50)在腦組織細(xì)胞中表達(dá)增加，實(shí)驗(yàn)大鼠腦水腫情況及損傷程度較外傷對(duì)照組明顯減輕[17]，說(shuō)明HBO可通過(guò)增強(qiáng)NF-κB(p50)活性對(duì)損傷神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)、修復(fù)的治療作用。Kassed等[18]報(bào)道NF-κB(p50)基因敲除小鼠海馬神經(jīng)元對(duì)腦損傷的反應(yīng)性受到影響，其記憶、學(xué)習(xí)能力降低。Li和Duckworth等[2,19]敲除小鼠NF-κB(p50)亞單位后，大腦中動(dòng)脈長(zhǎng)期閉塞后的梗死面積及死亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，腦損傷程度加劇。

腦損傷后NF-κB水平升高既有可能與腦損傷應(yīng)激、損傷后繼發(fā)炎性反應(yīng)及氧化損害等刺激活化相關(guān)；也有可能是反應(yīng)性地激活不同亞單位，通過(guò)增加某些抗凋亡因子的合成和分泌，阻斷細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用。高壓氧已用于臨床重型顱腦創(chuàng)傷治療，在今后臨床工作中，是否可以通過(guò)監(jiān)測(cè)NF-κB水平，從而個(gè)性化選擇高壓氧治療起始時(shí)間、加壓程度和治療周期以期達(dá)到最大療效。因此，如何監(jiān)測(cè)及確定NF-κB在何種水平能夠準(zhǔn)確提示腦損傷程度及判斷高壓氧治療后的炎性反應(yīng)程度，還有待進(jìn)一步研究。

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(2014-06-26收稿 2014-08-20修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

Effect of hyperbaric oxygenation treatment on expression of NF-κB p50 in the rat brain tissue after traumatic brain injury

YANG Bolin, WANG Huan, PENG Jun, XU Qiming, and YU Chao.

Department of Neurological Surgery,Jiangxi Provincial Corps Hospital,Chinese People’s Armed Police Forces，Nanchang 330030, China

Objective To observe the effect of hyperbaric oxygenation treatment(HBOT) on expression of NF-κB(p50) in the rat brain tissue after traumatic brain injury(TBI) and discuss its mechanism. Methods Thirty-five Sprague-Dawley rats were divided into sham operation control group(5 rats), TBI group(15 rats) and HBOT group(15 rats). Based on the Feeney’s model of modified Allen’s method, experimental animals were treated with HBOT. The animals were sacrificed at the 8th hour, and on days 1,3,5,8,respectively. The expression of protein NF-κB was determined by Westernblotting. Results The expression of NF-κB was significantly higher in traumatic group than that in control group at the time of 8 hour and 1,3,5and 8 days after injury (P<0.05).The level of NF-κB reached peak on the 3th day, and maintained a high status from 5 to 8 days. Compared with traumatic group, the NF-κB level was significantly lower in the HBOT group (P<0.05). Conclusion HBOT can weaken NF-κB expression in traumatic brain tissue and inhibit effectively inflammatory response, which provides theoretical basis for treating severe traumatic brain injury.

severe brain injury; hyperbaric oxygenation; rats; NF-κB

楊柏林，本科學(xué)歷，主任醫(yī)師，E-mail:jxncy62@163.com

330030南昌，武警江西總隊(duì)醫(yī)院神經(jīng)外科

R651.11