韓蓮花，蔡 磊，朱 瑩，朱華亭，夏永潔，邱玉華

螺內(nèi)酯誘導(dǎo)人急性白血病細(xì)胞Jurkat凋亡的作用研究

韓蓮花，蔡 磊，朱 瑩，朱華亭，夏永潔，邱玉華*

目的 研究螺內(nèi)酯對人急性白血病細(xì)胞Jurkat體外增殖的抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用。方法 將終濃度分別是10、50及100 μmol/L的螺內(nèi)酯加入Jurkat細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，24 h內(nèi)每隔4 h通過 MTT法分析Jurkat細(xì)胞的增殖抑制率，Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)法分析Jurkat細(xì)胞的早期凋亡率。結(jié)果 螺內(nèi)酯與Jurkat細(xì)胞共同培養(yǎng)12 h后，螺內(nèi)酯能顯著增加對細(xì)胞的增殖抑制作用，并且與藥物濃度成正相關(guān)，各濃度組的抑制率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而升高，與藥物干預(yù)時(shí)間成正相關(guān)；螺內(nèi)酯處理Jurkat細(xì)胞24 h，各濃度組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率分別為：10 μmol/L組(11.2±0.35)%、50 μmol/L組(29.8±1.27)%及100 μmol/L(56.5±1.41)%，各個(gè)濃度組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率與藥物濃度成正相關(guān)。結(jié)論 螺內(nèi)酯對人T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，提示該藥可能具有潛在抑瘤作用。

螺內(nèi)酯；Jurkat；增殖抑制；細(xì)胞凋亡

0 引言

螺內(nèi)酯(Spironolactone)是一種臨床上常用的醛固酮拮抗劑,主要用于治療與醛固酮升高有關(guān)的頑固性水腫、高血壓及原發(fā)性醛固酮增多癥等疾病。它通過結(jié)合胞漿內(nèi)的鹽皮質(zhì)激素受體而作為醛固酮的拮抗劑發(fā)揮藥理作用[1]。主要作用于腎臟遠(yuǎn)曲小管和集合管，通過阻斷Na+-K+和Na+-H+的交換，使Na+、Cl-和水排泄增多，K+、Mg2+和H+排泄減少，有較強(qiáng)的利尿作用，故該藥在心力衰竭患者的治療中也起著重要的作用[2]。

近年來隨著研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)了螺內(nèi)酯新的作用。Mikkelsen等[3]報(bào)道螺內(nèi)酯能誘導(dǎo)人體外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡，并且影響其細(xì)胞因子的分泌。這為腫瘤的治療提供了新的思路。本研究以人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat為對象，分析螺內(nèi)酯對腫瘤細(xì)胞生長與增殖的影響，以期為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Jurkat細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；螺內(nèi)酯購自Sigma公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒(invitrogen公司)；RPMI 1640(GIBCO公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；MTT、DMSO(Sigma公司)；550型酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株的培養(yǎng) 取本實(shí)驗(yàn)室保存的Jurkat細(xì)胞株，常規(guī)復(fù)蘇后，RPMI 1640培養(yǎng)液添加10%胎牛血清，于37 ℃、5% CO2、飽和適度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。觀察細(xì)胞生長情況，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 螺內(nèi)酯對Jurkat細(xì)胞增殖抑制作用的分析 取生長狀態(tài)良好的Jurkat細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL，接種于96孔板，200 μL/孔，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各實(shí)驗(yàn)組加入螺內(nèi)酯溶液，使其終濃度分別為10、50及100 μmol/L。另設(shè)不加藥的對照組，分別于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為4、8、12、16、20及24 h。培養(yǎng)終止前4 h，加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)孵育4 h，離心后吸棄孔板內(nèi)培養(yǎng)上清液。加入DMSO 150 μL，微量振蕩器上振蕩搖勻，使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀檢測吸光度值(A570)，并計(jì)算增殖抑制率[4]。

細(xì)胞增殖抑制率=(A對照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對照組×100%

1.2.3 螺內(nèi)酯對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用的分析 用含10%胎牛血清RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/mL，接種于6孔板，2 mL/孔。加入螺內(nèi)酯溶液，使終濃度分別為10、50及100 μmol/L，并設(shè)不加藥的對照組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次后，將細(xì)胞重懸于100 μL緩沖液，轉(zhuǎn)移至流式管中。加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 1μL，室溫避光孵育15 min，孵育過后，加入400 μL緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡率[5]。

2 結(jié)果

2.1 螺內(nèi)酯對Jurkat細(xì)胞增殖抑制作用 螺內(nèi)酯與Jurkat細(xì)胞共同培養(yǎng)4 h和8 h時(shí)，各濃度組對細(xì)胞的增殖抑制作用并不顯著，各濃度組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。共同培養(yǎng)12、16、20及24 h時(shí)，各濃度組對細(xì)胞增殖均呈現(xiàn)明顯的抑制作用，且同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)各濃度組間抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。螺內(nèi)酯與Jurkat細(xì)胞共同培養(yǎng)12 h后，對細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)明顯的對藥物濃度和干預(yù)時(shí)間的依賴性(見圖1)。

表1 螺內(nèi)酯對Jurkat細(xì)胞增殖抑制率的影響

注：與對照組比較，*P<0.05

圖1 不同濃度螺內(nèi)酯在各干預(yù)時(shí)間點(diǎn)對Jurkat細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 螺內(nèi)酯對Jurkat細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用 螺內(nèi)酯處理細(xì)胞24 h,對照組與10、50及100 μmol/L各濃度組誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞早期凋亡率分別為(2.9±0.23)%、(11.2±0.35)%、(29.8±1.27)%及(56.5±1.41)%，凋亡率呈現(xiàn)明顯的藥物濃度依賴性(見圖2)。

3 討論

螺內(nèi)酯與鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合而作為醛固酮的拮抗劑發(fā)揮藥理作用，對抗高血壓、醛固酮增多癥等，在臨床上已經(jīng)使用了近40年，對其藥理作用機(jī)制已較清晰[6]。近年來臨床與基礎(chǔ)方面的研究又發(fā)現(xiàn)了一些關(guān)于螺內(nèi)酯與鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合之外的其他作用。臨床研究報(bào)道，螺內(nèi)酯還具有提高充血性心衰患者的生存期，改善內(nèi)皮功能等作用[7-8]?；A(chǔ)研究方面，有研究發(fā)現(xiàn)，螺內(nèi)酯誘導(dǎo)人體外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡，并且影響其細(xì)胞因子的生成。人體外周血單個(gè)核細(xì)胞與100 μmol/L的螺內(nèi)酯共培養(yǎng)后，抑制了細(xì)胞因子TNF-α的生成，卻增加了IL-1β的生成，并初步猜測凋亡的發(fā)生可能與IL-1β的增多有關(guān)。Soren等發(fā)現(xiàn)，螺內(nèi)酯誘導(dǎo)人體外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過抑制NF-кB這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子而起作用，并且這種作用不依賴于鹽皮質(zhì)激素受體[9-10]。他們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，螺內(nèi)酯影響很多與炎癥因子和凋亡過程的相關(guān)基因，當(dāng)人體外周血單個(gè)核細(xì)胞和不同濃度螺內(nèi)酯共同培養(yǎng)后，caspase-3的活性增強(qiáng)，而NF-кB的活性降低，初步認(rèn)為螺內(nèi)酯可能是通過抑制NF-кB的活性而誘導(dǎo)人體外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡[10]。

A：對照組，B：10 μmol/L組，C：50 μmol/L組，D：100 μmol/L組

為了探討螺內(nèi)酯對某些腫瘤細(xì)胞是否也有誘導(dǎo)凋亡的作用，本研究選擇了Jurkat細(xì)胞作為研究對象，通過兩種方法來分析不同濃度螺內(nèi)酯和Jurkat細(xì)胞共同培養(yǎng)后對該細(xì)胞的作用。首先通過MTT法分析不同濃度螺內(nèi)酯在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對Jurkat細(xì)胞的增殖抑制作用。在4 h和8 h的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，螺內(nèi)酯對Jurkat細(xì)胞的增殖抑制作用并不顯著，從12 h開始，不同濃度的螺內(nèi)酯對Jurkat細(xì)胞產(chǎn)生了顯著的增殖抑制作用，并且其作用呈現(xiàn)藥物濃度和干預(yù)時(shí)間的依賴性。其次，通過Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)法分析螺內(nèi)酯誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的作用。根據(jù)MTT的結(jié)果，我們選擇了24 h作為研究早期凋亡的時(shí)間點(diǎn)，分析不同濃度螺內(nèi)酯誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的作用。發(fā)現(xiàn)最小濃度10 μmol/L螺內(nèi)酯對Jurkat細(xì)胞就已經(jīng)有誘導(dǎo)凋亡的作用，并且藥物干預(yù)濃度越高，其誘導(dǎo)凋亡的作用越強(qiáng)，存在明顯的濃度依賴性。在研究中由于螺內(nèi)酯的溶解度問題，我們沒能選擇更高濃度來分析。

本研究通過觀察螺內(nèi)酯誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞的調(diào)亡情況，說明螺內(nèi)酯可能對某些血液腫瘤細(xì)胞也有誘導(dǎo)凋亡的作用，接下來我們還會選擇其他的腫瘤細(xì)胞作為研究對象，更深入地研究螺內(nèi)酯誘導(dǎo)凋亡的作用。而本實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，我們也將從NF-кB途徑開始作下一步研究。

總之，螺內(nèi)酯對人T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用，體外誘導(dǎo)凋亡的劑量亦較低，提示該藥可能存在潛在的抑瘤作用，對于我們尋求改善淋巴細(xì)胞白血病的方法也具有潛在的價(jià)值。

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Study on apoptosis of human T-acute lymphoblastic leukemia cells lines Jurkat treated with spironolactone

HAN Lian-hua,CAI Lei,ZHU Ying,ZHU Hua-ting,XIA Yong-jie,QIU Yu-hua

(Department of Immunology,Medical College,Soochow University,Suzhou 215123,China)

Objective To study the proliferated inhibition and apoptosis of human T-acute lymphoblastic leukemia cells lines Jurkat treated with spironolactone.Methods Jurkat cells were treated with different concentrations of spironolactone (10,50,100 μmol/L) in culture.MTT assay was used to observe the proliferated inhibition rate of Jurkat at 4 hours interval and the flow cytometry was applied to analyze Annexin V/PI apoptosis rate of Jurkat.Results 12 hours after treatment,spironolactone could obviously inhibit the proliferation of Jurkat and the effect had dose and treated time dependence.24 hours after treatment,apoptosis of these concentrations were(11.2±0.35)%,(29.8±1.27)%,(56.5±1.41)%,and the apoptosis rate increased in dose dependence.Conclusion Spironolactone can inhibit the proliferation and induce apoptosis of Jurkat,it suggests that this medicine may have the effect of tumor inhibition.

Spironolactone;Jurkat;Proliferated inhibition;Cell apoptosis

2013-10-25

蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系，蘇州 215123

江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃(CXLX12_0821)

*通信作者