許曄+宋亮

摘要：在乳及乳制品中添加皮革水解蛋白對乳及乳制品的生產(chǎn)和消費產(chǎn)生很大負面影響，引起社會各方關(guān)注，為保證乳及乳制品的質(zhì)量安全，急需快速、簡便的民用檢測乳及乳制品中是否含有皮革水解蛋白。本研究建立了乳及乳制品中皮革水解蛋白檢測方法，該方法中樣品無需進行前處理，2 mL乳及乳制品中加入2 mL硫酸，100 ℃水浴 6.5 min 進行顯色反應(yīng)。結(jié)果表明，該方法對乳及乳制品中皮革水解蛋白最低檢測限為0.25 mg/mL，滿足簡便、快速的定性分析要求。

關(guān)鍵詞：乳；乳制品；皮革水解蛋白；快速檢測

中圖分類號： R155.5+7文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0264-02

收稿日期：2013-06-18

作者簡介：許曄（1980—），男，江蘇常州人，博士，講師，研究方向為食品安全。E-mail：cukexu@gmail.com。蛋白質(zhì)是乳及乳制品中的主要營養(yǎng)成分，但是一些不法企業(yè)為謀取暴利，在乳及乳制品中添加有機化工原料、不合法的動植物蛋白等，以提高蛋白質(zhì)含量。近年來，媒體頻繁報道的“皮革奶”事件讓乳品產(chǎn)業(yè)受到一次次重創(chuàng)[1]。摻假乳會直接引起食品安全問題，影響奶農(nóng)、生產(chǎn)廠家和消費者的利益[2-3]。在常規(guī)檢測牛奶中蛋白含量時，結(jié)果是乳制品中總蛋白質(zhì)含量，而不是乳制品中乳蛋白的實際含量[2-3]，而皮革水解蛋白與三聚氰胺不同的是，它由皮革經(jīng)過化學、生物技術(shù)處理，水解出原有的蛋白（膠原蛋白），是真正的蛋白質(zhì)。所以，皮革水解蛋白添加在乳及乳制品中更為隱蔽，檢測難度更大。

若是較為純凈的皮革水解蛋白被人服用后傷害不大，而不法商販是將生產(chǎn)皮衣、皮沙發(fā)、皮包等皮革下角料進行化學、生物水解后制得的皮革水解產(chǎn)物添加到兌了水的牛奶中以提高蛋白含量，而鞣質(zhì)皮革下角廢料中含有重金屬鉻（VI），含有鉻離子的牛奶被人服用后，可造成人體重金屬中毒，導(dǎo)致關(guān)節(jié)疏松、關(guān)節(jié)腫大。近期國家衛(wèi)生部已將皮革水解蛋白公布為食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種（第二批）[4-5]。

目前，檢測乳制品中是否添加皮革水解蛋白的常規(guī)方法有顯色環(huán)法[6]、超聲乳成分分析法[7]、石墨爐原子法[8]、比色法[9]、高效液相色譜法[10]、離子交換色譜一積分脈沖安培法[11]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)法[12]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法[13]和氨基酸自動分析儀法[14]。常見的檢測方法大都為定量分析，操作復(fù)雜、耗時長，不利于普通百姓用于快速簡便定性檢測。目前皮革奶定性分析方法僅有顯色環(huán)法[6]，但該方法需要水浴濃縮，耗時較長。本研究試圖建立乳及乳制品中皮革水解蛋白簡便快速的定性檢測方法，利于普通百姓在日常生活中對乳及乳制品中是否添加皮革水解蛋白進行簡便定性檢測，為乳與乳制品監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

皮革水解蛋白粉（蛋白質(zhì)含量78%），特侖蘇純牛奶（經(jīng)過GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》[9]的方法未測出水解蛋白，為合格乳，蛋白含量31%）。以上材料的蛋白質(zhì)含量均由凱氏定氮法[15-16]測得。

正常牛奶每100 mL約含有蛋白質(zhì)3.4 g、脂肪1.3 g（考慮到直接添加脂肪與水不容且脫脂奶中無脂肪，以下的模擬皮革奶中未加入脂肪），碳水化合物（主要是乳糖）5.0 g，根據(jù)以上配比取0.43 g的皮革水解蛋白（蛋白含量約為0.34 g），加入10 mL蒸餾水，0.5 g的乳糖，混合均勻再與15 mL的合格乳樣混勻（提高合格乳添加量可保證皮革水解蛋白充分溶解）。最終制得的添加皮革水解蛋白粉的自制皮革奶25 mL。用皮革水解蛋白制得的皮革奶自制樣外觀與正常牛奶一樣，乳白色，無異味，且經(jīng)凱氏定氮操作測得蛋白含量與合格乳相近（蛋白含量大于2.95%為合格乳）。

1.2方法

1.2.1試劑配置硫酸溶液的濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L。

1.2.2溫度對顯色反應(yīng)的影響在3支試管中分別加入 4 mL 皮革奶和2 mL 3 mol/L硫酸，分別放入80、90、100 ℃溫度的水浴中，記錄不同水浴溫度下開始顯色的時間。

1.2.3硫酸濃度對顯色反應(yīng)的影響在7支試管中各加入皮革奶4 mL和2 mL不同濃度硫酸溶液，另取1支試管加入2 mL正常奶及2 mL蒸餾水，混勻后再加入2 mL 3.0 mol/L 的硫酸溶液，該試管作為空白管。將8支試管放置于100 ℃水浴，記錄不同試管顯粉紅色的時間。

1.2.4皮革奶顯色檢出限在7支試管中各加入2 mL不同濃度（皮革奶中皮革水解蛋白粉含量分別為30、20、10、5、1、05、0.1、0.05 mg/mL）的皮革奶和2 mL 3.0 mol/L硫酸溶液，另取1支試管加入2 mL正常奶與2 mL 3 mol/L 硫酸，分別放入100 ℃水浴中，記錄皮革水解蛋白不同濃度皮革奶在10 min內(nèi)顯粉紅色的程度。

2結(jié)果與分析

2.1溫度對顯色反應(yīng)的影響

由表1可見，水浴溫度越高，顯色越明顯；水浴溫度越高，顯色時間越短。100 ℃水浴條件下顯色時間比80 ℃水浴條件下顯色時間短356 min。

2.2硫酸濃度對顯色反應(yīng)的影響

由表2可知，皮革奶顯色所需時間隨硫酸濃度提高而縮短，使用3.0 mol/L硫酸的顯色時間只需要209 s，僅為使用0.5 mol/L硫酸所需時間的38.63%。

2.3皮革奶顯色檢出限

由表3可見，當皮革奶中皮革水解蛋白粉添加量為 0.25 mg/mL 時，顯色開始不明顯，此時皮革奶中皮革粉濃度為 0.25 mg/mL。

3討論endprint

用酸法單獨水解制皮革水解蛋白粉及牛奶中添加皮革水解蛋白粉制皮革奶時可以觀察到，皮革水解蛋白粉在酸性條件下自身會水解為淡粉紅色混合物，而混有皮革水解蛋白粉的乳樣加酸后，經(jīng)過一段時間的高溫水浴，會呈現(xiàn)更深的粉紅色，而正常奶加酸水浴，則不會呈現(xiàn)粉紅色。該顯色方法無需對樣品進行前處理，試劑簡單，操作方便，可以初步判斷乳樣中是否添加了皮革粉。

由溫度對顯色的影響試驗可以看出，水浴溫度越高，顯色越明顯，顯色時間越短，考慮操作的方便與簡便，建議水浴溫度為100 ℃。通過酸濃度對顯色的影響試驗可以看出，硫酸濃度越高，顯色越明顯，顯色所需時間越短，為考慮到安全性及顯色時效性，建議硫酸濃度取2 mol/L。同時試驗結(jié)果表明，皮革奶中皮革水解蛋白的最低檢出限為0.25 mg/mL。

當水浴溫度為100 ℃，酸的濃度取2 mol/L，經(jīng)過382 s，皮革奶直接顯色，達到快速簡便檢測的效果。而傳統(tǒng)的比色法判斷乳樣中是否添加了皮革水解蛋白必須先將乳樣進行水解使其游離出特征氨基酸L-羥脯氨酸，然后進行氧化再與顯色劑反應(yīng)顯色，該方法對于定性定量判斷乳樣是否為皮革奶雖然可靠穩(wěn)定，但涉及到水解步驟，適于實驗室檢測，而其他檢測皮革水解蛋白的方法如色譜法及其他儀器檢測法都涉及昂貴的儀器，對樣品的前期及后期處理較為繁瑣，且操作要求高，不適于民用，而本研究建立的直接顯色法操作簡便，對儀器要求很低，所用試劑和儀器為2 mol/L的硫酸和試管，適于民用檢測。當然，該方法只能對于添加皮革水解蛋白的皮革奶進行檢測，若乳樣中添加豬皮粉或者動物水解蛋白，那么該方法的靈敏性較差，但考慮到豬皮粉較貴不適于作為動物蛋白添加劑，而動物水解蛋白大多是有鹽酸水解中和而來，顏色為棕黃色且其中的氯離子也容易檢測不適于作為蛋白添加劑，所以本研究建立的直接顯色法有一定的應(yīng)用價值。

參考文獻：

[1]李葉雙，陸有飛，李理論. 思考中國動物性食品安全保障[J]. 廣西畜牧獸醫(yī)，2011，27（3）：178-179.

[2]趙洋，吳穎，路勇，等. 解析乳及乳制品中添加皮革水解蛋白問題[J]. 食品工業(yè)科技，2010，31（8）：377-380.

[3]許曄，宋 亮，凌靖. 檢測方法研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（2）：251-254.

[4]劉學琴，徐栓朝，高建龍，等. 生鮮乳中添加皮革水解蛋白的測定方法研究[J]. 乳業(yè)科學與技術(shù)，2010，33（4）：188-192.

[5]金蘇英，林笑容，趙志紅，等. 高效液相色譜法測定奶粉及其他乳制品中的L-羥脯氨酸[J]. 飲料工業(yè)，2009，12（7）：28-30.

[6]蔣儒林，張金麗. 關(guān)于原奶摻假提高脂肪和蛋白質(zhì)含量的檢驗方法[J]. 中國乳業(yè)，2005，4（3）：37-39.

[7]王衍彬，劉東紅，葉興乾，等. 超聲乳成分分析儀對牛乳摻水解動物蛋白粉和脲的檢測效果研究[J]. 中國食品學報，2005，5（2）：98-102.

[8]烏尼爾，胡桂林，高娃，等. 石墨爐原子吸收法測定乳和乳制品中的鉻[J]. 中國乳品工業(yè)，2009，37（6）：51-53.

[9]GB/T 9695.23—2008肉與肉制品羥脯氨酸含量測定[S]. 北京：中國標準出版社，2008：1-5.

[10]鄒曉莉，黎源倩，曾紅燕，等. 反相高效液相色譜法測定人肌腱中的膠原蛋白[J]. 色譜，2006，24（3）：263-266.

[11]丁永勝，牟世芬.氨基酸直接分析法原理及應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代儀器，2002，38（1）：11-14.

[12]夏金根，陳波，姚守拙.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定膠原蛋白中的羥脯氨酸[J]. 色譜，2008，26（5）：595-598.

[13]趙燕燕，劉麗艷，杜光玲，等. 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定奶制品中動物水解蛋白[J]. 食品科學，2010，31（20）：282-285.

[14]劉智廣，馬海燕.膠原特異性氨基酸快速測定方法的研究及應(yīng)用[J]. 氨基酸雜志，1994（3）：8-12.

[15]陳智慧，史梅，王秋香，等. 用凱式定氮法測定食品中的蛋白含量[J]. 新疆畜牧業(yè)，2008（5）：22-24.

[16]郭穎娜，孫衛(wèi). 蛋白質(zhì)含量測定方法的比較[J]. 河北化工，2008，31（4）：36-37.endprint

用酸法單獨水解制皮革水解蛋白粉及牛奶中添加皮革水解蛋白粉制皮革奶時可以觀察到，皮革水解蛋白粉在酸性條件下自身會水解為淡粉紅色混合物，而混有皮革水解蛋白粉的乳樣加酸后，經(jīng)過一段時間的高溫水浴，會呈現(xiàn)更深的粉紅色，而正常奶加酸水浴，則不會呈現(xiàn)粉紅色。該顯色方法無需對樣品進行前處理，試劑簡單，操作方便，可以初步判斷乳樣中是否添加了皮革粉。

由溫度對顯色的影響試驗可以看出，水浴溫度越高，顯色越明顯，顯色時間越短，考慮操作的方便與簡便，建議水浴溫度為100 ℃。通過酸濃度對顯色的影響試驗可以看出，硫酸濃度越高，顯色越明顯，顯色所需時間越短，為考慮到安全性及顯色時效性，建議硫酸濃度取2 mol/L。同時試驗結(jié)果表明，皮革奶中皮革水解蛋白的最低檢出限為0.25 mg/mL。

當水浴溫度為100 ℃，酸的濃度取2 mol/L，經(jīng)過382 s，皮革奶直接顯色，達到快速簡便檢測的效果。而傳統(tǒng)的比色法判斷乳樣中是否添加了皮革水解蛋白必須先將乳樣進行水解使其游離出特征氨基酸L-羥脯氨酸，然后進行氧化再與顯色劑反應(yīng)顯色，該方法對于定性定量判斷乳樣是否為皮革奶雖然可靠穩(wěn)定，但涉及到水解步驟，適于實驗室檢測，而其他檢測皮革水解蛋白的方法如色譜法及其他儀器檢測法都涉及昂貴的儀器，對樣品的前期及后期處理較為繁瑣，且操作要求高，不適于民用，而本研究建立的直接顯色法操作簡便，對儀器要求很低，所用試劑和儀器為2 mol/L的硫酸和試管，適于民用檢測。當然，該方法只能對于添加皮革水解蛋白的皮革奶進行檢測，若乳樣中添加豬皮粉或者動物水解蛋白，那么該方法的靈敏性較差，但考慮到豬皮粉較貴不適于作為動物蛋白添加劑，而動物水解蛋白大多是有鹽酸水解中和而來，顏色為棕黃色且其中的氯離子也容易檢測不適于作為蛋白添加劑，所以本研究建立的直接顯色法有一定的應(yīng)用價值。

參考文獻：

[1]李葉雙，陸有飛，李理論. 思考中國動物性食品安全保障[J]. 廣西畜牧獸醫(yī)，2011，27（3）：178-179.

[2]趙洋，吳穎，路勇，等. 解析乳及乳制品中添加皮革水解蛋白問題[J]. 食品工業(yè)科技，2010，31（8）：377-380.

[3]許曄，宋 亮，凌靖. 檢測方法研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（2）：251-254.

[4]劉學琴，徐栓朝，高建龍，等. 生鮮乳中添加皮革水解蛋白的測定方法研究[J]. 乳業(yè)科學與技術(shù)，2010，33（4）：188-192.

[5]金蘇英，林笑容，趙志紅，等. 高效液相色譜法測定奶粉及其他乳制品中的L-羥脯氨酸[J]. 飲料工業(yè)，2009，12（7）：28-30.

[6]蔣儒林，張金麗. 關(guān)于原奶摻假提高脂肪和蛋白質(zhì)含量的檢驗方法[J]. 中國乳業(yè)，2005，4（3）：37-39.

[7]王衍彬，劉東紅，葉興乾，等. 超聲乳成分分析儀對牛乳摻水解動物蛋白粉和脲的檢測效果研究[J]. 中國食品學報，2005，5（2）：98-102.

[8]烏尼爾，胡桂林，高娃，等. 石墨爐原子吸收法測定乳和乳制品中的鉻[J]. 中國乳品工業(yè)，2009，37（6）：51-53.

[9]GB/T 9695.23—2008肉與肉制品羥脯氨酸含量測定[S]. 北京：中國標準出版社，2008：1-5.

[10]鄒曉莉，黎源倩，曾紅燕，等. 反相高效液相色譜法測定人肌腱中的膠原蛋白[J]. 色譜，2006，24（3）：263-266.

[11]丁永勝，牟世芬.氨基酸直接分析法原理及應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代儀器，2002，38（1）：11-14.

[12]夏金根，陳波，姚守拙.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定膠原蛋白中的羥脯氨酸[J]. 色譜，2008，26（5）：595-598.

[13]趙燕燕，劉麗艷，杜光玲，等. 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定奶制品中動物水解蛋白[J]. 食品科學，2010，31（20）：282-285.

[14]劉智廣，馬海燕.膠原特異性氨基酸快速測定方法的研究及應(yīng)用[J]. 氨基酸雜志，1994（3）：8-12.

[15]陳智慧，史梅，王秋香，等. 用凱式定氮法測定食品中的蛋白含量[J]. 新疆畜牧業(yè)，2008（5）：22-24.

[16]郭穎娜，孫衛(wèi). 蛋白質(zhì)含量測定方法的比較[J]. 河北化工，2008，31（4）：36-37.endprint

用酸法單獨水解制皮革水解蛋白粉及牛奶中添加皮革水解蛋白粉制皮革奶時可以觀察到，皮革水解蛋白粉在酸性條件下自身會水解為淡粉紅色混合物，而混有皮革水解蛋白粉的乳樣加酸后，經(jīng)過一段時間的高溫水浴，會呈現(xiàn)更深的粉紅色，而正常奶加酸水浴，則不會呈現(xiàn)粉紅色。該顯色方法無需對樣品進行前處理，試劑簡單，操作方便，可以初步判斷乳樣中是否添加了皮革粉。

由溫度對顯色的影響試驗可以看出，水浴溫度越高，顯色越明顯，顯色時間越短，考慮操作的方便與簡便，建議水浴溫度為100 ℃。通過酸濃度對顯色的影響試驗可以看出，硫酸濃度越高，顯色越明顯，顯色所需時間越短，為考慮到安全性及顯色時效性，建議硫酸濃度取2 mol/L。同時試驗結(jié)果表明，皮革奶中皮革水解蛋白的最低檢出限為0.25 mg/mL。

當水浴溫度為100 ℃，酸的濃度取2 mol/L，經(jīng)過382 s，皮革奶直接顯色，達到快速簡便檢測的效果。而傳統(tǒng)的比色法判斷乳樣中是否添加了皮革水解蛋白必須先將乳樣進行水解使其游離出特征氨基酸L-羥脯氨酸，然后進行氧化再與顯色劑反應(yīng)顯色，該方法對于定性定量判斷乳樣是否為皮革奶雖然可靠穩(wěn)定，但涉及到水解步驟，適于實驗室檢測，而其他檢測皮革水解蛋白的方法如色譜法及其他儀器檢測法都涉及昂貴的儀器，對樣品的前期及后期處理較為繁瑣，且操作要求高，不適于民用，而本研究建立的直接顯色法操作簡便，對儀器要求很低，所用試劑和儀器為2 mol/L的硫酸和試管，適于民用檢測。當然，該方法只能對于添加皮革水解蛋白的皮革奶進行檢測，若乳樣中添加豬皮粉或者動物水解蛋白，那么該方法的靈敏性較差，但考慮到豬皮粉較貴不適于作為動物蛋白添加劑，而動物水解蛋白大多是有鹽酸水解中和而來，顏色為棕黃色且其中的氯離子也容易檢測不適于作為蛋白添加劑，所以本研究建立的直接顯色法有一定的應(yīng)用價值。

參考文獻：

[1]李葉雙，陸有飛，李理論. 思考中國動物性食品安全保障[J]. 廣西畜牧獸醫(yī)，2011，27（3）：178-179.

[2]趙洋，吳穎，路勇，等. 解析乳及乳制品中添加皮革水解蛋白問題[J]. 食品工業(yè)科技，2010，31（8）：377-380.

[3]許曄，宋 亮，凌靖. 檢測方法研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（2）：251-254.

[4]劉學琴，徐栓朝，高建龍，等. 生鮮乳中添加皮革水解蛋白的測定方法研究[J]. 乳業(yè)科學與技術(shù)，2010，33（4）：188-192.

[5]金蘇英，林笑容，趙志紅，等. 高效液相色譜法測定奶粉及其他乳制品中的L-羥脯氨酸[J]. 飲料工業(yè)，2009，12（7）：28-30.

[6]蔣儒林，張金麗. 關(guān)于原奶摻假提高脂肪和蛋白質(zhì)含量的檢驗方法[J]. 中國乳業(yè)，2005，4（3）：37-39.

[7]王衍彬，劉東紅，葉興乾，等. 超聲乳成分分析儀對牛乳摻水解動物蛋白粉和脲的檢測效果研究[J]. 中國食品學報，2005，5（2）：98-102.

[8]烏尼爾，胡桂林，高娃，等. 石墨爐原子吸收法測定乳和乳制品中的鉻[J]. 中國乳品工業(yè)，2009，37（6）：51-53.

[9]GB/T 9695.23—2008肉與肉制品羥脯氨酸含量測定[S]. 北京：中國標準出版社，2008：1-5.

[10]鄒曉莉，黎源倩，曾紅燕，等. 反相高效液相色譜法測定人肌腱中的膠原蛋白[J]. 色譜，2006，24（3）：263-266.

[11]丁永勝，牟世芬.氨基酸直接分析法原理及應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代儀器，2002，38（1）：11-14.

[12]夏金根，陳波，姚守拙.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定膠原蛋白中的羥脯氨酸[J]. 色譜，2008，26（5）：595-598.

[13]趙燕燕，劉麗艷，杜光玲，等. 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定奶制品中動物水解蛋白[J]. 食品科學，2010，31（20）：282-285.

[14]劉智廣，馬海燕.膠原特異性氨基酸快速測定方法的研究及應(yīng)用[J]. 氨基酸雜志，1994（3）：8-12.

[15]陳智慧，史梅，王秋香，等. 用凱式定氮法測定食品中的蛋白含量[J]. 新疆畜牧業(yè)，2008（5）：22-24.

[16]郭穎娜，孫衛(wèi). 蛋白質(zhì)含量測定方法的比較[J]. 河北化工，2008，31（4）：36-37.endprint