郭玉梅，周吉坤，張慧賢，秦麗云，趙 冬，劇慧棟

(1.石家莊市疾病預防控制中心微生物檢驗所，河北石家莊 050011;2.河北省血液中心檢驗科，河北 石家莊 050011)

嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila，Lp)可引起急性呼吸道傳染病，臨床類型至少有肺炎型和龐蒂亞克熱型。嗜肺軍團菌有15個血清型，環(huán)境和臨床標本中以血清1型最常見。目前對嗜肺軍團菌的分子分型方法有基因序列分型(Sequence based typing，SBT)、脈沖場凝膠電泳分型(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)、擴增片斷長度多態(tài)性分型(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)等。AFLP方法曾經(jīng)作為流行病學分型的快速篩查方法，首次被EWGLI所采用［1-2］;PFGE方法在國內(nèi)外也一直是被認可的細菌溯源研究的分型方法［3］;近年，基于多個等位基因序列差異的SBT分型方法，受到研究者的關(guān)注，日益成為研究細菌分型方法的主流方法，Ratzow［4］在Gaia做SBT分型研究的基礎上增加了neuA提高了SBT的分辨率。該方法目前已廣泛應用于細菌性疾病暴發(fā)的分子溯源和進化研究［5］。SBT分型方法通過大量的測序序列與生物分析軟件相結(jié)合，便于研究者的比對分析，為流行病學調(diào)查和建立細菌分子生物學數(shù)據(jù)庫積累資料。本文選用了SBT、PFGE、AFLP三種分型方法對石家莊市6所醫(yī)院冷卻塔水來源的嗜肺軍團菌進行了分子分型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集石家莊市6所醫(yī)院冷卻塔水標本分離的32株嗜肺軍團菌，菌株經(jīng)生化鑒定及軍團菌膠乳凝集試劑盒進行血清學分型，其中Lp1型24株，Lp2-14型8株。標準菌株為嗜肺軍團菌ATCC 33152，由中國疾病預防控制中心傳染病所饋贈。

1.1.2 主要儀器與試劑 PTC-200型PCR擴增儀(美國 M.J.Research PCR 公司)、QIAxcel型全自動毛細管電泳儀(德國 Qiagen公司)、bioMerieux DENSIMAT比濁儀、Chemi Genius2型凝膠成像系統(tǒng)(美國SYNGENE公司)、ND-1000型DNA濃度測定儀(美國Thermo Nanodrop公司)、CHEF Mapper型脈沖場凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司)。CYE基礎培養(yǎng)基、BCYE添加劑和GVPC添加劑均購自英國Oxoid公司，DNA提取試劑盒(德國 Qiagen公司)，Seakem Gold瓊脂糖(美國Cambrex公司)，AscI核酸內(nèi)切酶(英國 Neb公司)，XbaI核酸內(nèi)切酶、蛋白酶 K均購自日本TaKaRa公司，PCR引物由大連寶生物合成，dNTP、DNA Polymerase、PrimeSTAR TM Buffer均購自日本TaKaRa公司，Pst1內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T4 DNA Ligase Buffer連接緩沖液均購自瑞士Roche公司，1×TE Buffer核酸電泳緩沖液(上海生工生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 嗜肺軍團菌DNA的制備 復蘇凍存嗜肺軍團菌菌株，挑取典型菌落傳代于BCYE培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。菌株DNA提取按照試劑盒操作，提取的DNA置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因序列分型(SBT) 選取7個等位基因，引物序列見表1。PCR反應體系:5×Prime-STAR TM Buffer(Mg2+)10 μL、dNTP(各 2.5 mmol/L)4 μL，上、下游引物(各 10 μmol/L)1 μL，DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL，模板DNA 4 μL(100 ng)，無菌純水定容至50 μL。PCR反應條件為94℃預變性5 min;94℃變性30 s、57.4℃ 退火30 s、72℃ 延伸40 s，35個循環(huán);72℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳后由上海生工進行純化和測序。測序結(jié)果經(jīng)Chromas軟件校對后用ContigExpress軟件進行序列拼接，將拼接好的7個管家基因序列在線提交到嗜肺軍團菌SBT分型數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站上(http://www.hpabioinformatics.org.uk)進行分析比對，獲得7個管家基因等位基因譜并確定其序列型(ST)。

表1 目的基因和PCR引物序列Table1 Purpose gene and amplification primers

續(xù)表

1.2.3 脈沖場凝膠電泳(PFGE) 操作方法參照文獻［6］。制備膠塊的菌懸液濃度為4.0～4.5個麥氏單位，將嗜肺軍團菌包埋于1%SeaKem Gold瓊脂糖內(nèi)，膠塊凝固后，用含有25 μL蛋白酶K(20 mg/mL)的細胞裂解液(CLB)進行裂解。每個膠塊用40 U的AscI酶37℃酶切4 h。沙門菌Braenderup血清型菌株H9812作為分子質(zhì)量標準，每個膠塊用40 U的XbaI酶37℃酶切4 h。脈沖場凝膠電泳條件:電壓為6.0 V/cm，電場夾角為120°，電泳時間19 h，電泳起始脈沖時間為6.8 s，終止脈沖時間為54.2 s。電泳結(jié)束后，將膠塊放入含1 μg/mL溴化乙錠的純水中染色并用純水脫色。采用凝膠成像儀獲取圖像。

1.2.4 擴增片段長度多態(tài)性分型(AFLP) 操作方法參照文獻［7］。提取嗜肺軍團菌DNA，采用DNA濃度測定儀測定DNA含量，含量需達到1.5 μg/μL以上。將模板DNA進行限制性酶切與連接反應。酶切體系為50 μL，包括1.5 μg/μL 基因組DNA 模板40 μL、PstI酶(20 U/μL)1 μL，10×緩沖液5 μL、100×BSA 溶液0.5 μL、滅菌蒸餾水3.5 μL。連接體系為30 μL，包括酶切產(chǎn)物6 μL、AFLP-LG1 6 μL、AFLP-LG2 6 μL、10×緩沖液3 μL、T4 DNA連接酶1 μL、滅菌蒸餾水8 μL。PCR反應體系:DNA 模板 5 μL，AFLP-PstI-G 0.4 μL，PCR Beads，滅菌蒸餾水19.6 μL，總體積25 μL。PCR反應條件:95℃預變性5 min，95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸150 s，35個循環(huán)，72℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像儀獲取圖像。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 ①聚類分析:采用BioNumerics4.0軟件，選擇Dice相關(guān)系數(shù)和非加權(quán)配對算數(shù)平均法(unweighted pair group average method，UPGMA)進行聚類分析;②分辨系數(shù)DI(Dimpson公式):

N:樣本全部菌株數(shù)，nj被歸入j組的菌株數(shù);③相似性系數(shù):2個圖像之間的相似性系數(shù)用距離法(Dice系數(shù)，dice coefficients，SD)計算，其計算方法為，其中，nx—菌株x的總條帶數(shù);ny—菌株y的總條帶數(shù);nxy—菌株x和菌株y共有的條帶數(shù)。SD值反映不同菌株P(guān)FGE圖像之間的相似性程度，范圍在0～l之間(0代表完全不同，1代表完全相同)。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜肺軍團菌SBT型別分布

24株Lp1血清型嗜肺軍團菌共分為4種ST型，SBT分型方法的分辨系數(shù)為0.239 1。分別為ST1型、ST345型、ST1201型和1株因neuA基因缺失而未分型。其中，ST1型為優(yōu)勢型占87.50%(21/24)，其余型別均為4.16%(1/24)，見表2。

從EWGLI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中對中國來源的嗜肺軍團菌繪制進化樹，顯示ST345型和ST1201型為本地區(qū)獨特型，且ST345型和ST1201型親緣關(guān)系最近。未實現(xiàn)分型的嗜肺軍團菌與其余23株菌分屬不同的克隆系，親緣關(guān)系較遠，見圖1。

圖1 1997至2009年EWGLI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中收錄的來自中國嗜肺軍團菌系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.1 Phylogenetic tree of Legionella-pneumophila from 1997 to 2009 in our country from EWGLI database

表2 32株嗜肺軍團菌SBT、PFGE、AFLP分型結(jié)果Table2 Subtyping results by SBT.PFGE and AFLP method of 32 Legionella-pneumophila

續(xù)表

2.2 嗜肺軍團菌脈沖場凝膠電泳圖譜(PFGE)分析

用SfiI內(nèi)切酶對32株嗜肺軍團菌進行限制性酶切后可產(chǎn)生8條左右大小為20～800 kb的電泳條帶?？煞譃?5型，分辨系數(shù)為0.925 4，見圖2。相似性系數(shù)最大為100%，最小為50%。

圖2 嗜肺軍團菌的脈沖場凝膠電泳圖Fig.2 Legionella-pneumophila pulse field gel electrophoresis figure

2.3 嗜肺軍團菌擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)電泳圖譜分析

32株嗜肺軍團菌菌株經(jīng)AFLP分析，都擴增得到7條左右大小為300～2 500 bp之間的電泳條帶。相似性系數(shù)最大為100%，最小為20%。32株Lp1血清型共分為23種AFLP型別，分辨系數(shù)為 0.973 7，見圖 3。

圖3 嗜肺軍團菌的AFLP電泳圖Fig.3 Legionella-pneumophila amplified fragment length polymorphism figure

3 討論

SBT分型技術(shù)是Gaia等［8］根據(jù)多位點測序分型原理建立的以測序為基礎的嗜肺軍團菌流行病學分型方法。它通過分析多個管家基因的內(nèi)部片段的核苷酸序列，從而對菌株的等位基因進行多樣性的比較，與國際數(shù)據(jù)庫比對獲得該菌株各管家基因的等位基因譜，并確定菌株的序列型即ST型。查閱國際菌株數(shù)據(jù)庫可確定其是新ST型或已有ST型。目前，SBT技術(shù)主要用于嗜肺軍團菌血清1型的分型，主要是由于嗜肺軍團菌交叉凝集現(xiàn)象嚴重，很難將Lp2-14型再進一步分型，所以對非1型嗜肺軍團菌流行病學調(diào)查受到限制。

PFGE又稱宏量限制性內(nèi)切酶分析(Macrorestriction analysis，MRA)，目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于各種致病菌所致疾病的溯源。PFGE方法可分析所有軍團菌，但PFGE技術(shù)操作復雜，且還未制定國際上的標準操作方法。因此，一般只限于一些具有熟練技能的操作人員以及相應設備的參考實驗室使用。

AFLP是由一個簡單的限制性連接反應和PCR擴增2步組成。首先，基因組DNA經(jīng)酶消化后，限制性片段連接到特殊構(gòu)建的接頭上。然后以PCR方法通過引物與接頭互補的方式，擴增這些標記好的限制性片段，再經(jīng)凝膠電泳找出限制性片段長度的多態(tài)性。歐洲軍團菌感染工作組已經(jīng)建立了嗜肺軍團菌血清1型AFLP分型的標準操作方法，但是此種分型方法所用引物取決于接頭，而接頭又和所用限制酶相聯(lián)系，因此對接頭技術(shù)要求較高且結(jié)果不穩(wěn)定。

本研究分別采用SBT、PFGE、AFLP分型方法對32株嗜肺軍團菌分離株進行了分子分型。結(jié)果顯示采用PFGE方法可將30株嗜肺軍團菌分為15個PFGE型，分辨系數(shù)為0.925 4，用AFLP方法可將32株嗜肺軍團菌分為23種AFLP型別，分辨系數(shù)為0.973 7。SBT方法可將24株Lp1嗜肺軍團菌分為4個ST型，分辨系數(shù)為0.239 1，低于PFGE法和AFLP法，與文獻報道相一致［9-10］。與此同時，ST型相同的菌株具有不同的PFGE和AFLP型別，提示在溯源研究方面，PFGE方法和AFLP方法優(yōu)于SBT分型方法。

但是，SBT在分析菌株的進化關(guān)系和流行分布方面具有一定的優(yōu)勢。本研究所分出的4個ST型中，ST1型為國內(nèi)外長期流行菌株并廣泛存在，ST345和ST1021型為本地區(qū)獨特型，ST345型僅出現(xiàn)在國外臨床來源菌株，國內(nèi)還未見有報道，而ST1021型國內(nèi)外還未見有報道。ST345和ST1021型作為本地區(qū)獨特型，在進化樹上遺傳距離近，與ST1型和ST未分型遺傳距離較遠。SBT結(jié)果還顯示，醫(yī)院冷卻塔水來源的嗜肺軍團菌7個等位基因的基因譜呈明顯的分子多態(tài)性。

綜上，SBT、PFGE、AFLP三種方法在嗜肺軍團菌分子分型方面各有側(cè)重點，其中，PFGE和AFLP分型能力強，但耗時長且實驗操作復雜，不能進行全球菌株資料的比對。SBT雖然分型能力低，但此方法最快速、簡便并能提供明確的結(jié)果，且在全球流行病學分布及遺傳進化方面優(yōu)于AFLP和PFGE法。

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