羅維貴，覃春艷，黃霞，鄧俊華，覃雪梅，許建國(guó)

（右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000 E－mail：luoweiguiluo＠163.com）

肺癌是在臨床上發(fā)病率最高的惡性腫瘤，盡管人們對(duì)其采用了積極和有效的防治措施，但其發(fā)病率及病死率依然呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢(shì)，為提高肺癌的早期診斷率和治療有效率及降低病死率，尋找與肺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)影響因素，特別是與肺癌相關(guān)的抑癌基因，成為其分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)課題。肝細(xì)胞核因子 3β（hepatocyte nuclear factor，HNF－3βor Foxa2）作為肺癌的抑癌基因之一，近期受到廣大學(xué)者的關(guān)注。而環(huán)氧化物酶－2（Cox－2）是一種誘導(dǎo)酶，其很少表達(dá)于正常組織，但人們發(fā)現(xiàn)，其參與了炎癥或腫瘤的病理生理發(fā)展過(guò)程，特別是受到多種刺激因子刺激后顯著表達(dá)，相關(guān)刺激因子主要包括：細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、促癌劑等。HNF－3β和Cox－2在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的發(fā)生發(fā)展關(guān)系及相互作用，迄今未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探討 HNF－3β和Cox－2在NSCLC中表達(dá)及其臨床意義，以期為肺癌的靶向治療提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取2006年10月～2012年10月在我院心胸外科手術(shù)切除的60例經(jīng)病理確診為NSCLC組織標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)組，并以與其相應(yīng)的距離癌組織5cm以上的50例正常肺組織標(biāo)本為對(duì)照組，60例患者術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療或靶向治療。在實(shí)驗(yàn)組中，男性為38例，女性為22例，年齡40～75歲，平均年齡為56.3歲；其中鱗癌20例，腺癌28例，腺鱗癌12例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期患者45例，Ⅲ期患者15例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。60例NSCLC中，獲隨訪者46例，隨訪率76.67% （46／60），隨訪時(shí)間5個(gè)月～5年，平均隨訪35.7個(gè)月。

1.2 方法 手術(shù)后所有新鮮標(biāo)本均即時(shí)用10%多聚甲醛溶液固定，用石蠟包埋制作保存，組織蠟塊進(jìn)行4μm厚連續(xù)切片后固定于載玻片上。切片厚度4μm分別行HE染色和免疫組化染色。取已知陽(yáng)性的切片做對(duì)照模板，用PBS代替做陰性對(duì)照模板。兔抗人Bcl－2單克隆抗體（SP21）和兔抗人HNF－3β單克隆抗體及相應(yīng)試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供，操作步驟均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 將染色為棕黃色和棕褐色顆粒作為Cox－2和HNF－3β陽(yáng)性信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)。判定方法為于高倍顯微鏡下（10×40）隨機(jī)選取10個(gè)不同視野，各計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，免疫組化染色結(jié)果采用雙盲方法測(cè)定。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分率分為4級(jí)：＜5%為0分；5%～24%為1分；25%～50%為2分；＞50%為3分。顯色度按細(xì)胞著色計(jì)分：無(wú)著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。取兩者評(píng)分之和的數(shù)值作為結(jié)果判定，0分為（－），＜4分為（＋），＞4分為（＋＋）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，Cox－2和 HNF－3β的表達(dá)、與臨床病理參數(shù)的關(guān)系等計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cox－2和 HNF－3β的表達(dá) 在NSCLC和癌旁正常組織中，Cox－2蛋白陽(yáng)性（見(jiàn)圖1）表達(dá)率分別為78.33%（47／60）和18.00%（9／50）；HNF－3β陽(yáng)性（見(jiàn)圖2）表達(dá)率分別為35.00% （21／60）和84.00%（42／50）。Cox－2在 NSCLC高表達(dá)，正常肺組織中低表達(dá)，而HNF－3β則與之相反，兩者陽(yáng)性表達(dá)率之間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 NSCLC及癌旁正常肺組織中Cox－2和HNF－3β蛋白表達(dá) （n）

2.2 NSCLC組織中Cox－2和HNF－3β的表達(dá)與臨床、病理特征的關(guān)系 Cox－2和HNF－3β的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類型無(wú)關(guān)（P＞0.05）。Cox－2的陽(yáng)性表達(dá)率與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)呈顯著相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與分化程度無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HNF－3β陽(yáng)性表達(dá)率與臨床TNM分期、分化程度、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呈明顯負(fù)相關(guān)（P ＜0.05），見(jiàn)表2。

圖1 Cox－2在肺癌組織中的表達(dá)

圖2 HNF－3β蛋白在肺癌組織中的表達(dá)

表2 NSCLC中Cox－2和HNF－3β蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表3 Cox－2和 HNF－3β蛋白在NSCLC中表達(dá)的相互關(guān)系

2.4 Cox－2和HNF－3β表達(dá)與NSCLC患者生存率的關(guān)系 在NSCLC患者中，獲隨訪的46例其術(shù)后1、3和5年生存率分別為77.78%（14／18）、44.44%（8／18）和22.22%（4／18），而Cox－2表達(dá)弱陽(yáng)性和陰性的28例患者其1、3和5年生存率分別為89.29%（25／28）、75.00%（21／28）和 53.57%（15／28），Cox－2強(qiáng)陽(yáng)性者1、3、5年生存率顯著下降（P ＜0.05）。46例獲隨訪的NSCLC患者中，6例HNF－3β強(qiáng)陽(yáng)性，其1、3和5年生存率均為98%，HNF－3β表達(dá)陰性的40例患者，其1、3和5 年 生 存 率 分 別 為 82.50% （33／40）、47.50% （19／40）和30.00%（12／40），呈顯著下降（P ＜0.05）。

3 討論

Cox－2是一種誘導(dǎo)型酶，其可以誘導(dǎo)花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素環(huán)內(nèi)過(guò)氧化物（PGG2），并經(jīng)一系列過(guò)程，最終將PGG2轉(zhuǎn)化成為另一種產(chǎn)物PGH2。Cox－2在正常組織中很少表達(dá)，可在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并在多種因子刺激下開(kāi)始產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)，Cox－2在腫瘤的細(xì)胞增殖、腫瘤血管形成及腫瘤的遠(yuǎn)處浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到了促進(jìn)作用。Richardsen等［1］研究提示，在原發(fā)性前列腺癌組織中Cox－2呈明顯高表達(dá)狀態(tài)。Singh B等［2］研究表明Cox－2在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展起到一定的促進(jìn)作用。趙曉鴻等［3］通過(guò)免疫組化檢測(cè)Cox－2、原癌基因c－fos編碼產(chǎn)物（c－Fos蛋白）、原癌基因c－jun編碼產(chǎn)物（c－Jun蛋白）以及活性T細(xì)胞核因子3（nuclear factor of activated Tcells3，NFAT3）在159例NSCLC中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在NSCLC組織中Cox－2的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄因子NFAT3和c－Fos的表達(dá)明顯相關(guān)，這提示NFAT3和c－Fos可能對(duì)Cox－2的表達(dá)起到了共同調(diào)節(jié)的作用。Baratelli等［4］在NSCLC中的研究也發(fā)現(xiàn)，TGF－β在PGE2的促進(jìn)下將純化的CD4＋轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)T細(xì)胞表型，而PGE2在相應(yīng)組織中的表達(dá)受到Cox－2的調(diào)控，這說(shuō)明Cox－2在腫瘤的免疫介導(dǎo)中起抑制作用。Luo等［5］在84例NSCLC患者手術(shù)后標(biāo)本中Cox－2的表達(dá)研究表明：在NSCLC中，Cox－2可上調(diào)VEGF和MVD在NSCLC的表達(dá)，同時(shí)還提示，加入PKC抑制劑后，可明顯降低了A549、A431和H460中的VEGF的表達(dá)，而加入PKC激活劑后則能增強(qiáng)VEGF的表達(dá)，因此我們得出：在NSCLC中，Cox－2能夠介導(dǎo)的VEGF的上調(diào)，而PKC路徑在此過(guò)程中起到了非常重要的作用。其VEGF的表達(dá)均明顯下調(diào)，說(shuō)明可調(diào)控VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤血管的生成。本研究結(jié)果顯示，Cox－2和HNF－3β的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類型無(wú)關(guān)。在正常組織中僅2例Cox－2表達(dá)為（＋），陽(yáng)性率為10%；60例NSCLC組織中43例表現(xiàn)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為71.67%。Cox－2的陽(yáng)性表達(dá)率與臨床分期、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)呈顯著相關(guān)性，且在Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)Ⅲ級(jí)病例中明顯高表達(dá)于Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)的病例，Cox－2的表達(dá)明顯影響著患者術(shù)后生存期的長(zhǎng)短，NSCLC患者中，其惡性程度越高，Cox－2的陽(yáng)性表達(dá)則明顯增強(qiáng)。Cox－2影響了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后，其機(jī)制可能是Cox－2促進(jìn)腫瘤血管的形成，提供了腫瘤生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)的途徑，并參與了腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

HNF－3β是HNF－3家族三個(gè)成員之一，它具有一個(gè)翼旋（wingedhelix）區(qū)，該區(qū)為一高度保守的DNA結(jié)合區(qū)，是以單體的形式結(jié)合［6］。相關(guān)體外的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在鱗癌、腺癌、NSCLC等大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中，其相關(guān)腫瘤細(xì)胞內(nèi)HNF－3β呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，在加入HNF－3β后，腫瘤細(xì)胞明顯增殖變慢、凋亡，這表明了HNF－3β是一種很強(qiáng)的肺癌抑制因子［7］。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展后期，TGF－β1可以促進(jìn)細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)化及促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，從而促進(jìn)了腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和免疫抑制作用。使其與肺癌，尤其是NSCLC的發(fā)生、進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有密切的關(guān)系，但其具體機(jī)制尚未完全明確［8］。提示HNF－3β能夠抑制肺癌形成過(guò)程中的上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化過(guò)程，阻礙了肺癌的形成、增殖、擴(kuò)散的作用［9］。本研究提示，HNF－3β在正常肺組織及NSCLC中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為83.3%和36%，其陽(yáng)性表達(dá)與TNM分期、組織病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，HNF－3β在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、腺癌及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中，表達(dá)陽(yáng)性率降低，提示HNF－3β在NSCLC侵襲、轉(zhuǎn)移中起一定抑制作用。在隨訪的46例NSCLC患者中我們發(fā)現(xiàn)：HNF－3β表達(dá)低下的患者，其總體無(wú)瘤生存期比 HNF－3β高表達(dá)者相對(duì)縮短，這表明了HNF－3β的表達(dá)可能與NSCLC患者的臨床預(yù)后存在一定的關(guān)系，能夠作為一種有待于開(kāi)發(fā)利用于肺癌分期及臨床預(yù)后的標(biāo)志物。

綜上所述，在NSCLC中Cox－2與HNF－3β的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，其中Cox－2的高表達(dá)、HNF－3β的低表達(dá)，兩者在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起了重要作用，并且與預(yù)后明顯相關(guān)，在基礎(chǔ)研究和臨床工作中檢測(cè)Cox－2和HNF－3β對(duì)促進(jìn)NSCLC患者的生物學(xué)行為研究和預(yù)測(cè)臨床預(yù)后有重要意義。為進(jìn)一步探討NSCLC發(fā)病機(jī)制以及探尋NSCLC治療新途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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