潘鑫艷，蔡 琳，黎貴蕓，楊長紹，楊舉倫，王 麗

高海拔地區(qū)FISH法檢測(cè)乳腺癌HER2基因的方法改進(jìn)

潘鑫艷，蔡 琳，黎貴蕓，楊長紹，楊舉倫，王 麗

目的 在高海拔地區(qū)改良并簡化乳腺癌HER2 FISH法檢測(cè)的預(yù)處理步驟，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，擴(kuò)大FISH檢測(cè)試劑盒的臨床應(yīng)用。方法 以10例HER2免疫組化染色結(jié)果為++以上的乳腺癌標(biāo)本為研究對(duì)象，采用美國PanPath公司的HER2 FISH檢測(cè)試劑盒，將其中的預(yù)處理步驟改良為高壓煮沸處理，比較常規(guī)法與改良法對(duì)HER2基因擴(kuò)增結(jié)果的影響。結(jié)果 兩種方法檢測(cè)乳腺癌HER2基因的陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且均能使細(xì)胞間質(zhì)完全消化，細(xì)胞或重疊或孤立，細(xì)胞核中紅綠信號(hào)清晰。結(jié)論 改良FISH法可以替代常規(guī)預(yù)處理步驟，簡化了步驟，節(jié)省了時(shí)間，擴(kuò)大了FISH檢測(cè)試劑盒的臨床應(yīng)用。

乳腺癌；FISH技術(shù)；HER2基因

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，在我國有些城市已躍居女性惡性腫瘤的第一位[1]。人表皮生長因子受體-2(HER2)在乳腺癌患者的高水平表達(dá)，對(duì)臨床治療方案的選擇有指導(dǎo)作用，尤其是針對(duì)單克隆抗體赫塞汀(Herceptin)的臨床應(yīng)用[2]。目前，應(yīng)用FISH技術(shù)檢測(cè)乳腺癌患者HER2基因擴(kuò)增是美國FDA承認(rèn)的能進(jìn)行Herceptin治療的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。

FISH法檢測(cè)步驟中，加探針之前的石蠟切片消化處理較繁瑣，處理時(shí)間過長，若能采用改良FISH法，簡化對(duì)切片進(jìn)行處理的繁瑣步驟，達(dá)到不影響FISH結(jié)果的判讀，又能得到省時(shí)、省力、省試劑的效果，必將會(huì)促進(jìn)FISH檢測(cè)在臨床的應(yīng)用。本研究采用常規(guī)FISH法和改良FISH法對(duì)10例浸潤性乳腺癌HER2基因進(jìn)行FISH檢測(cè)，比較這兩種方法檢測(cè)HER2基因的陽性率以及紅綠信號(hào)強(qiáng)度、結(jié)果判讀之間的差異。

1 材料與方法

1.1 驗(yàn)地氣候條件 本實(shí)驗(yàn)在海拔1890 m、大氣壓80.6 kPa、水的沸點(diǎn)為93.4 ℃的昆明地區(qū)進(jìn)行。

1.2 材料與設(shè)備 選取本科2012～2013年的浸潤性乳腺癌免疫組化HER2染色陽性++以上的石蠟組織標(biāo)本10例，連續(xù)4 μm切片2張，于60 ℃烤2～4 h，室溫保存。美國PanPath公司生產(chǎn)的FISH檢測(cè)試劑盒，購自北京中杉公司。Olympus BX51顯微鏡。

1.3 標(biāo)本處理

1.3.1 常規(guī)FISH法 參照PanPath HER2試劑盒說明書進(jìn)行：(1)脫蠟至無水酒精2次，甲醇孵育5 min，空氣干燥。(2)預(yù)處理：①0.003%～85%甲酸溶液室溫孵育20 min后，0.01M HCl清洗3 min；②70%、90%、100%酒精連續(xù)酸性系列脫水后空氣干燥10 min；③80 ℃預(yù)熱的處理液NaSCN中孵育10 min，0.01M HCl清洗3 min，重復(fù)步驟②；④37 ℃預(yù)熱的酸性蛋白水解酶工作液孵育8 min，0.01M HCl清洗3 min，重復(fù)步驟②；⑤Post-fix solution室溫孵育15 min；⑥PBS室溫漂洗15 min；(3)去離子水漂洗5 min；(4)70%、90%、100%酒精中性脫水后空氣干燥。(5)探針變性雜交：加探針，80 ℃變性5 min，37 ℃雜交過夜(16 h 以上)。(6)洗滌及漂洗：PBS中去除蓋玻片，PanWash3洗滌及PBS漂洗，梯度酒精脫水，避光干燥10 min，在每張切片上滴加10 μl 二脒基苯基吲哚(DAPI)，蓋上蓋玻片；避光放置15 min，鏡下觀察。

1.3.2 改良FISH法 將上述“(2)預(yù)處理”改為高壓煮沸，并對(duì)高壓煮沸的時(shí)間進(jìn)行摸索，分別設(shè)為4、6、8 min。具體步驟如下：(1)脫蠟至無水酒精，空氣干燥。(2)去離子水中高壓煮沸：高壓鍋大量噴氣時(shí)開始計(jì)時(shí)4～8 min，室溫晾干；37 ℃預(yù)熱的酸性蛋白水解酶工作液孵育8 min；(3)去離子水漂洗5 min；(4)70%、90%、100%酒精中性脫水后空氣干燥。后續(xù)步驟同常規(guī)FISH法。

1.4 觀察指標(biāo)及判斷標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞消化：細(xì)胞間質(zhì)消化徹底，可見清晰、重疊或孤立的細(xì)胞核，細(xì)胞間質(zhì)幾乎不存在；細(xì)胞間質(zhì)消化不足時(shí)，可見細(xì)胞間質(zhì)存在，細(xì)胞核之間無明顯界限；細(xì)胞間質(zhì)消化過度，細(xì)胞間質(zhì)完全不存在，細(xì)胞核呈空洞現(xiàn)象。

結(jié)果判讀：同一顯微鏡100×物鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)20個(gè)乳腺癌細(xì)胞核中的雙色信號(hào)：(1)若HER2基因擴(kuò)增(紅色信號(hào))與17號(hào)染色體信號(hào)(綠色信號(hào))的比值<1.8，提示HER2基因無擴(kuò)增；(2)若該比值>2.0，提示HER2基因陽性擴(kuò)增；(3)若比值為1.8～2.0，則需要再計(jì)算20個(gè)細(xì)胞核中的信號(hào)或由另一個(gè)分析者重新計(jì)數(shù)，如仍為臨界值，則應(yīng)直接注明或重復(fù)進(jìn)行FISH檢測(cè)；(4)若紅色信號(hào)成簇，兩個(gè)綠色信號(hào)，提示HER2基因陽性并成簇?cái)U(kuò)增，其中17號(hào)染色體為二倍體；(5)若紅色信號(hào)成簇，多個(gè)綠色信號(hào)，提示HER2基因陽性并成簇?cái)U(kuò)增，其中17號(hào)染色體為多倍體。

2 結(jié)果

乳腺癌細(xì)胞核DAPI染成藍(lán)色，紅色熒光為HER2基因，17號(hào)染色體著絲粒序列標(biāo)記綠色熒光。

2.1 常規(guī)FISH法檢測(cè)乳腺癌HER2擴(kuò)增結(jié)果(圖1) 10例標(biāo)本中，7例發(fā)生HER2基因擴(kuò)增，陽性率為70%?？梢娂?xì)胞間質(zhì)消化徹底，容易計(jì)數(shù)單個(gè)細(xì)胞及其紅綠信號(hào)，但預(yù)處理步驟需要4～5 h完成。

2.2 改良FISH法檢測(cè)乳腺癌HER2擴(kuò)增結(jié)果(圖2)

2.2.1 不同高壓時(shí)間對(duì)組織消化的影響 高壓鍋大量噴氣時(shí)開始計(jì)時(shí)，若高壓煮沸時(shí)間為4 min時(shí)，細(xì)胞間質(zhì)消化不完全(圖2a)；高壓煮沸時(shí)間為6 min時(shí)，細(xì)胞間質(zhì)消化徹底(圖2b)；高壓煮沸時(shí)間為8 min，細(xì)胞間質(zhì)消化過度(圖2c)。

2.2.2 改良FISH法檢測(cè)乳腺癌HER2擴(kuò)增結(jié)果(圖3) 用改良法(將預(yù)處理步驟改為高壓煮沸6 min)檢測(cè)上述10例標(biāo)本，結(jié)果顯示：7例標(biāo)本發(fā)生HER2基因擴(kuò)增，陽性率為70%，并且該7例標(biāo)本與常規(guī)FISH法的陽性標(biāo)本一致，處理過程只需要1.5 h，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，節(jié)省了試劑。

圖1 乳腺癌HER2基因FISH常規(guī)法檢測(cè)結(jié)果

a：17號(hào)染色體為2倍體，HER2基因無擴(kuò)增;b：17號(hào)染色體為2倍體，HER2基因擴(kuò)增

圖2 不同高壓煮沸時(shí)間檢測(cè)結(jié)果

a：細(xì)胞間質(zhì)消化不完全;b：細(xì)胞間質(zhì)消化徹底;c：細(xì)胞消化過度

圖3 乳腺癌HER2基因FISH改良法檢測(cè)結(jié)果

a：17號(hào)染色體為2倍體，HER2基因無擴(kuò)增;b：17號(hào)染色體為多倍體，HER2基因擴(kuò)增

3 討論

乳腺癌患者中，約有20%～30%的HER2基因的擴(kuò)增和(或)蛋白過表達(dá)，與乳腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)臨床治療也有一定的指導(dǎo)意義[4]。該基因過表達(dá)提示乳腺癌惡性程度高，有轉(zhuǎn)移傾向，通過檢測(cè)HER2水平可對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)判，為治療方案的選擇提供依據(jù)。美國食品和藥品管理局(FDA)認(rèn)可的HER2基因檢測(cè)方法有IHC法、FISH和CISH法，而FISH技術(shù)能準(zhǔn)確地反映HER2基因狀態(tài)，被譽(yù)為“金標(biāo)準(zhǔn)”[3,5]。

FISH技術(shù)會(huì)受到諸多因素的影響，但最主要的影響因素卻是組織固定和切片的前期處理[6]。王躍華等[7]對(duì)PanPath公司的試劑盒常規(guī)預(yù)處理與已成熟用于顯色原位雜交(chromogenic in situ hybridization，CISH)法(改良法)進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)常規(guī)法優(yōu)于改良法，改良法細(xì)胞間質(zhì)消化不完全，雖然細(xì)胞核中紅綠信號(hào)清晰，但不易計(jì)數(shù)單個(gè)無重疊細(xì)胞，但卻表明簡化預(yù)處理步驟具有可行性。 FISH法檢測(cè)過程中，石蠟切片預(yù)處理步驟較繁瑣(見“1.3.1 常規(guī)FISH法”)，處理時(shí)間長，整個(gè)過程需要4～5 h，浪費(fèi)了大量時(shí)間。為了既能簡化FISH檢測(cè)試劑盒的復(fù)雜的預(yù)處理步驟，又能獲得穩(wěn)定和準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，達(dá)到省時(shí)、省力、省試劑的效果。本研究用去離子水煮沸的方法代替常規(guī)FISH法步驟(2)的全部處理?？紤]昆明大氣壓低，水的沸點(diǎn)低，僅為93.4 ℃，煮沸效果與海平面地區(qū)應(yīng)有差異[8]。市售家用壓力鍋的公稱壓力均為80 kPa，昆明地區(qū)的大氣壓強(qiáng)約為80.6 kPa，其噴氣時(shí)水的溫度為111.8 ℃，在大氣壓強(qiáng)為100 kPa的地區(qū)(海平面)，80 kPa壓力鍋噴氣時(shí)水溫為113.7 ℃，二者相差僅1.9 ℃。如果用單純煮沸加熱或微波煮沸加熱，則昆明地區(qū)與海平面水的沸點(diǎn)相差6.6 ℃(100 vs.93.4)[8]。因此，本研究采用高壓煮沸代替普通煮沸，并摸索最佳煮沸時(shí)間，才能達(dá)到預(yù)期效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：常規(guī)FISH法檢測(cè)10例浸潤性乳腺癌免疫組化HER2染色陽性++以上的石蠟組織標(biāo)本的陽性率與改良FISH法相同。改良FISH法處理的乳腺癌石蠟組織細(xì)胞間質(zhì)被完全消化，只留下單個(gè)的細(xì)胞或重疊或孤立，在熒光顯微鏡下清晰可見單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)大小一致、無重疊、核邊界完整、DAPI染色均一、信號(hào)清晰的細(xì)胞核比較容易，與常規(guī)FISH法處理的結(jié)果無差異，完全可以代替常規(guī)FISH法來檢測(cè)乳腺癌HER2基因。而且改良FISH法步驟簡單易操作，只需在去離子水中高壓煮沸6 min(高壓鍋大量噴氣時(shí)開始計(jì)時(shí))，蛋白酶消化時(shí)間縮短至1 h ，就可以進(jìn)行后續(xù)的探針與變性，在實(shí)際工作中節(jié)省了時(shí)間，也增加了FISH檢測(cè)HER2試劑盒在高海拔地區(qū)的應(yīng)用范圍。從原理上分析，高壓煮沸的處理方法同樣可以代替其他公司的FISH檢測(cè)試劑盒中的普通煮沸法，但由于不同高海拔地區(qū)的大氣壓強(qiáng)不同，各地應(yīng)摸索適合自己實(shí)驗(yàn)室的高壓煮沸時(shí)間。在低海拔地區(qū)通常采用普通煮沸法，煮沸時(shí)間需要15～30 min，而采用高壓煮沸方法來代替，可以將時(shí)間縮短到幾分鐘，甚至比在高海拔地區(qū)需要的時(shí)間更短，可減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高工作效率。

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Improvement in the detection of HER2 gene in breast cancer by fluorescence in situ hybridization at high altitude

Pan Xinyan,Cai Lin,Li Guiyun,Yang Changshao,Yang Julun,Wang Li

Department of Pathology,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To improve and simplify the pretreatment procedure of fluorescent in situ hybridization(FISH)technique in the detection of HER2 gene in breast cancer tissues at high altitude,and to save the experiment time and promote the clinical application of FISH detection kit.Methods Ten breast cancer samples which had the HER2 immunohistochemistry staining results of ++ were selected as the subjects.FISH kits from American PanPath company were used to change the pretreatment procedure into high-pressure boiling.Comparison was made in the effects of conventional and modified methods on the amplification of HER2 gene.Results There was no significant difference in the positive rate of HER2 gene detected by the two methods which both could make the intercellular substance digestion completely,the cells overlapped or isolated,and the red and green signal in the cell nucleus clear.Conclusion The modified FISH method can take the place of the common pretreatment,simplify the procedure,save the time,and promote the clinical application of the FISH detection kit.

breast cancer;fluorescence in situ hybridization;HER2 gene

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81201759)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2012FB210)

650032 昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院病理科

王 麗，E-mail：2001wl@163.com

R 737.9

A

1004-0188(2014)01-0017-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.01.007

2013-09-12)