姚麗敏，曠 慧，張 龍，常 晨，龍 雪，王金玲，王 萍，趙 鑫

（東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）

榛子是著名的四大堅果之一。在我國東北、華北、西南橫斷山及西北、內(nèi)蒙古均有大量野生榛林分布。近幾年，人工栽培面積不斷擴大，僅遼寧省鐵嶺市2008年就栽植人工榛林70多萬畝。目前東北地區(qū)榛子的年產(chǎn)量1億公斤左右，其中大于80%的榛子作為輔料被廣泛用于巧克力、焙烤等食品行業(yè)。其加工、食用后的廢棄物——榛子殼除少部分作為制造活性炭的原料以外[1-2]，并沒有得到充分的利用[3]。榛子殼中富含類黃酮棕色素[4]，具有抗衰老、降脂、美容、養(yǎng)顏等重要的生理活性功能[5-8]，備受食品、藥品、化妝品等行業(yè)青睞，是國內(nèi)外公認作為替代合成色素的資源。近年來，對榛子殼棕色素的提取、穩(wěn)定性及抗氧化性的研究已有報道[9-11]，但對于榛子殼棕色素的純化工藝方面研究較少。

本文旨在通過研究大孔樹脂對榛子殼棕色素的純化，篩選出最佳樹脂及得出最佳純化工藝，為榛子殼棕色素開發(fā)生產(chǎn)提供了一定的參考，為不斷壯大的榛子加工業(yè)提供棕色素純化工藝和新的發(fā)展方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榛子 購自伊春市五營林業(yè)局；手工去仁 榛子殼烘干粉碎，備用；無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸 均為國產(chǎn)分析純；大孔樹脂：D101、D4020、AB-8、X-5、NKA-9 購自哈爾濱盛達生化儀器公司。

ALC-1104分析天平 北京賽利多斯儀器系統(tǒng)有限公司；恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；UV-1200紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；FWl00萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；DFC-6053真空干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 榛子殼棕色素粗提液的制備 參照文獻[12]制得榛子殼棕色素粗提液。

1.2.2 色素吸收波長的確定 根據(jù)分光光度法，將色素的粗提液在200～500nm區(qū)間進行掃描，確定色素吸收波長。

1.2.3 最佳樹脂的篩選

1.2.3.1 靜態(tài)吸附效果比較 分別稱取2g預(yù)處理[13]后的D101（非極性）、D4020（非極性）、X-5（弱極性）、AB-8（弱極性）、NKA-9（極性）樹脂于250mL錐形瓶中，加入5mL色素粗提液。每隔30min測定其上層溶液的吸光值，繪制不同型號樹脂對榛子殼棕色素的吸附曲線。

1.2.3.2 靜態(tài)解吸效果比較 分別稱取2g預(yù)處理后的D101、D4020、AB-8、X-5、NKA-9樹脂于250mL錐形瓶中，加入5mL色素粗提液，振蕩使其充分吸附。吸附飽和后，棄去上層溶液，加入5mL 70%乙醇[14]溶液，每隔30min測定其上層溶液的吸光值，繪制不同型號樹脂對榛子殼棕色素的解吸曲線。

1.2.4 D101樹脂靜態(tài)實驗

1.2.4.1 樣液pH對吸附效果的影響 稱取7份質(zhì)量為2.0g的樹脂于250mL錐形瓶中，分別添加pH=2、3、4、5、6、7、8的榛子殼棕色素粗提液5mL，每隔30min測定其上層溶液的吸光值，繪制D101對不同pH的榛子殼棕色素粗提液的吸附曲線，計算其吸附率[15-16]，公式如下：

吸附率（%）=[A0（吸附前）-A（吸附后）]/A0（吸附前）×100

1.2.4.2 樣液稀釋倍數(shù)對吸附效果的影響 稱取6份質(zhì)量為2.0g的樹脂于250mL錐形瓶中，分別添加稀釋倍數(shù)為5、10、15、20、25、30倍的榛子殼棕色素粗提液5mL（原樣液濃度為750mg/mL），每隔20min測定其上層溶液的吸光值，繪制D101對不同稀釋倍數(shù)的樣液的吸附曲線并計算其吸附率。

1.2.4.3 乙醇濃度對解吸效果的影響 稱取5份質(zhì)量為2.0g的樹脂于250mL錐形瓶中，加入5mL濃度為30mg/mL的樣液，待其吸附飽和后，棄去上層溶液；分別加入5mL濃度為50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液，將其放入搖床中振蕩24h，使其充分解吸，測定其吸光值，比較其解吸效果。

1.2.5 D101樹脂動態(tài)實驗

1.2.5.1 上樣流速對吸附效果的影響 用充分活化的樹脂裝柱（3cm×50cm）于26cm處，將100mL濃度為30mg/mL榛子殼棕色素粗提液分別以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL/min的流速上樣。收集流出液，每管5mL，直至流出液吸光值為上柱液的10%（泄漏點）[17-18]，即認為樹脂吸附飽和，繪制樹脂在不同上樣流速下對榛子殼棕色素粗提液的吸附曲線。

1.2.5.2 上樣體積對吸附效果的影響 用充分活化的樹脂裝柱（3cm×50cm）于26cm處，以2mL/min分別加入70、90、110、130、150mL濃度為30mg/mL色素粗提液，小管收集流出液，每管5mL，直至流出液吸光值為上柱液的10%（泄漏點），即認為樹脂吸附飽和，繪制樹脂對色素的吸附曲線。

1.2.5.3 洗脫流速對解吸效果的影響 用充分活化的樹脂裝柱（3cm×50cm）于26cm處，將110mL濃度為30mg/mL的樣液以2mL/min的流速上樣。待樹脂吸附飽和后，用70%的乙醇溶液分別以流速1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL/min進行解吸，繪制解吸曲線。

1.2.6 色價的測定 將純化前后的色素濃縮液分別于50℃[19]烘箱中干燥，得到粉末狀的榛子殼棕色素。測定色素的色價，公式如下[20]：

式中，A為吸光度；W為100mL被測溶液中所含樣品的質(zhì)量（g）；R為100mL溶液稀釋至上機測試的稀釋倍數(shù)表示樣品濃度為1%，1cm比色皿測得的色價值。

1.2.7 洗脫率的計算 洗脫率計算公式如下[21]：洗脫率（%）=C×V（/C0×V0）×100。

式中，C和V分別為洗脫液中榛子殼棕色素的質(zhì)量濃度（mg/mL）和體積（mL）；C0和V0分別為吸附前溶液中榛子殼棕色素的質(zhì)量濃度（mg/mL）和體積（mL）。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 每個實驗3次重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±標準差顯示，數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 榛子殼棕色素吸收波長的測定

波長掃描曲線如圖1所示。

圖1 光譜掃描曲線Fig.1 The curve of spectral scanning

在200～500nm的波長范圍內(nèi)對提取液進行掃描，在235nm處有最大吸收，因此本實驗選擇235nm為測定波長。

2.2 最佳樹脂的篩選

2.2.1 不同型號樹脂對榛子殼棕色素的靜態(tài)吸附 考察不同型號樹脂在不同時間段對榛子殼棕色素的靜態(tài)吸附的影響，其結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在120min時，D4020對榛子殼棕色素的吸附趨于飽和，在200min時，樹脂AB-8和X-5對榛子殼棕色素的吸附趨于飽和，在240min時，樹脂NKA-9及D101對榛子殼棕色素的吸附趨于飽和。在200min之后，上清液的吸光值大小順序為：X-5＞NKA-9＞D4020＞D101＞AB-8，由此可見，AB-8大孔樹脂對榛子殼棕色素的吸附效果最好，D101次之。

圖2 5種不同大孔樹脂的吸附曲線Fig.2 Absorption curves of five different macro-porous resins

2.2.2 不同型號樹脂對榛子殼棕色素的靜態(tài)解吸 考察不同型號樹脂在不同時間段對榛子殼棕色素的靜態(tài)解吸的影響，其結(jié)果見圖3。

圖3 5種不同大孔樹脂的解吸曲線Fig.3 Desorption curves of five different macro-porous resins

由圖3可知，在160min以后，不同型號樹脂對榛子殼棕色素的解吸達到平衡，而上清液的吸光值的大小順序為：D4020＞D101＞X-5＞AB-8＞NKA-9。

結(jié)合圖2和圖3可知，雖然AB-8對榛子殼棕色素的吸附效果最好，但由于其與榛子殼棕色素結(jié)合過于緊密，使其解吸比較困難。因此，綜合考慮不同型號樹脂對榛子殼棕色素吸附和解吸的影響，樹脂D101為分離純化榛子殼棕色素的最佳樹脂。

2.3 D101樹脂靜態(tài)實驗

2.3.1 樣液pH對吸附效果的影響 樣液pH對吸附效果的影響如圖4和表1所示。

圖4 樣液pH對靜態(tài)吸附的影響Fig.4 The effect of different pH of sample solution on static absorption

由圖4可知，在吸附了20min之后，榛子殼棕色素溶液的吸光值都有了較大程度的下降，在200min時基本達到吸附飽和。

表1 樣液pH對樹脂靜態(tài)吸附的影響Table 1 The effect of different pH of sample solution on static absorption

由表1可知，隨著pH的增大，色素吸附率逐漸增大，pH=4時色素吸附率達到最大，并且顏色也最佳，在pH＜4時，榛子殼棕色素溶液的顏色變淺，這是由于氫離子濃度的不同對發(fā)色基團的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響[22]。之后隨著pH增大色素吸附率降低很快，pH=5后基本上趨于穩(wěn)定。

2.3.2 樣液稀釋倍數(shù)對吸附效果的影響 樣液稀釋倍數(shù)對吸附效果的影響如圖5和表2所示。

圖5 不同稀釋倍數(shù)對吸附的影響Fig.5 The effect of different dilution of sample solution on absorption

由圖5所示，在80min之后D101樹脂對各濃度的溶液基本上都吸附飽和，所以樣液的稀釋倍數(shù)對吸附飽和的時間基本上沒有太大的影響。

由表2可知，隨著稀釋倍數(shù)的增加，即隨著樣液濃度的降低，吸附率逐漸增大，在稀釋到25倍時，吸附率達到最大，即達到80.1%。之后隨著稀釋倍數(shù)的增加，吸附率又逐漸下降，因此樣液應(yīng)經(jīng)過適當稀釋后應(yīng)用于實驗。上官新晨等[23]利用大孔樹脂對紫紅薯色素吸附和解吸的特性研究中也給了同樣的結(jié)論，即適當?shù)慕档蜆右簼舛?，更有利于吸附，也有報道認為樣液濃度越大越有利于吸附[24-25]，還有報道認為樣液濃度對樹脂吸附性能影響不大[26]，這可能是各實驗所選樣液濃度范圍差異和色素性質(zhì)差異所致。在本實驗中25倍為最佳稀釋倍數(shù)，即最佳上樣濃度為30mg/mL。

表2 不同稀釋倍數(shù)對靜態(tài)吸附的影響Table 2 The effect of different dilution of sample solution on absorption

2.3.3 乙醇濃度對解吸效果的影響 乙醇濃度對解吸效果的影響如表3所示。

表3 不同濃度的乙醇解吸液的吸光值Table 3 Absorbency of different alcohol desorption concentration

由表3可知，隨著乙醇濃度的增加，解吸效果逐漸變好，在乙醇濃度達到70%后，解吸液吸光值趨于穩(wěn)定，由實驗結(jié)果可得乙醇濃度為70%是最佳的選擇，既可以將色素很好地解吸出來，又避免了乙醇的浪費。

2.4 D101樹脂動態(tài)實驗

2.4.1 上樣流速對吸附效果的影響 上樣流速對吸附效果的影響如圖6所示。

圖6 不同上樣流速對吸附的影響Fig.6 The effect of different velocity of flow on absorption

由圖6可知，色素溶液上樣的流速對吸附能力的影響比較大，大孔樹脂柱層析是一種動態(tài)吸附過程，色素溶液上樣流速的變化直接影響色素在樹脂內(nèi)部的擴散，從而影響吸附效果。流速過快，溶質(zhì)分子還來不及擴散到樹脂內(nèi)表面，就會發(fā)生泄漏現(xiàn)象，如當上樣流速為3.0mL/min時，當管號為21時就已經(jīng)到達泄露點，色素溶液與樹脂接觸時間短，這不利于樹脂很好地吸附色素，吸附效率大大下降，也造成了物料的浪費；流速過慢，操作時間長，也降低了工作效率。因此，樣液上樣流速控制在1.5～2.0mL/min效果最佳。

2.4.2 上樣體積對吸附效果的影響 上樣體積對吸附效果的影響如圖7所示。

圖7 上樣體積對吸附效果的影響Fig.7 The effect of sample volume on absorption

由圖7可知，上樣體積為70mL時，樹脂沒有吸附飽和，降低了純化效率；而當上樣體積為130mL和150mL時，泄露點過早到達，造成資源浪費；當上樣體積為90mL和110mL時，達到泄露點的時間相近，考慮到純化效率，本實驗最佳的上樣體積為110mL。

2.4.3 洗脫流速對解吸效果影響 洗脫流速對解吸效果的影響如圖8所示。

圖8 洗脫流速對解吸效果的影響Fig.8 The effect of velocity of flow on desorption

由圖8可知，隨著洗脫的進行，流出液中榛子殼棕色素的濃度升高到最大以后，又迅速降低，此時已收集到大部分色素，當流出液為無色時，說明洗脫已完成。當洗脫流速過大時，如2.5～3.0mL/min，對洗脫出的色素溶液富集效果較差，而且流速為1.0、2.5、3.0mL/min時基線吸收較高，也不利于富集，同時有一定的拖尾現(xiàn)象。當洗脫流速為1.0mL/min時，工作效率過低，而當洗脫流速為1.5～2.0mL/min時，不僅對榛子殼棕色素有富集效果，也無拖尾現(xiàn)象，因此，洗脫流速為1.5～2.0mL/min時，洗脫效果最佳。

2.5 榛子殼棕色素純化前后的色價比較

榛子殼中棕色素的含量較為豐富，用上述實驗所確定的最佳純化條件對榛子殼棕色素進行分離純化，進行純化前后光譜掃描，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，純化后的色素溶液在240～300nm的范圍內(nèi)吸收大大降低，可見除去了一部分雜質(zhì)。對比純化前后光譜掃描曲線可知，純化后的榛子殼棕色素的純度有了一定程度的提高。根據(jù)公式=A×R/W計算可知，色價由22.3提高到了46.8，洗脫率為83.4%。

圖9 光譜掃描曲線Fig.9 The curve of spectral scanning

3 結(jié)論

在所選的5種樹脂中，D101對榛子殼棕色素有較好的吸附和解吸能力，適用于榛子殼棕色素的分離純化。結(jié)合D101靜態(tài)實驗和動態(tài)實驗結(jié)果，D101樹脂分離純化榛子殼棕色素的最佳條件為：樣液pH=4.0，上樣濃度為30mg/mL，上樣體積為110mL，上樣流速為1.5～2.0mL/min；洗脫劑為70%的乙醇，洗脫流速為1.5～2.0mL/min為最佳純化條件。經(jīng)D101純化的色素，色價從22.3提高到了46.8，洗脫率可達83.4%。

作為食品著色劑，榛子殼棕色素可廣泛用于飲料、果凍、冰淇淋等加工工業(yè)中；還可用于化妝品，染料等工業(yè)。作為一種新興的天然食品著色劑，榛子殼棕色素必定會有很好的發(fā)展前景。

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