鄺敏杰，吳 鬧，齊敏玉，何靜仁，2，*，李書藝，鄧 莉，2，陳 軒，2

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)糧油食品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心，湖北武漢 430023）

花色苷（anthocyanins）是一類廣泛存在于果蔬類植物中的水溶性天然色素，屬類黃酮多酚化合物，具有重要生物活性和生理功能[1-3]。大部分天然花色苷由于其本身結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性而極大限制其在產(chǎn)品加工和貯藏過(guò)程中的直接應(yīng)用[4]?；ㄉ昭苌铮ˋnthocyanin derivatives）是近些年發(fā)現(xiàn)于花色苷果蔬的加工產(chǎn)品如葡萄酒和飲料或某些特殊類的植物中[4-5]，由花色苷在發(fā)酵和陳釀過(guò)程中經(jīng)一系列生物和化學(xué)反應(yīng)形成的，或在植物體內(nèi)經(jīng)生物代謝形成的一系列較穩(wěn)定的花色苷天然衍生物。因此，花色苷衍生物家族的形成及其在食品加工中的重要性已越來(lái)越引起科研人員的興趣和重視。

甲基吡喃花色苷（methyl-pyranoanthocyanins）是花色苷衍生物家族的一種。它的基本結(jié)構(gòu)是在原花色苷結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，在花色苷的C4位與C5位的羥基之間經(jīng)環(huán)加合反應(yīng)形成另外的第四個(gè)吡喃環(huán)D[5-6]（結(jié)構(gòu)如圖1）。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)甲基吡喃花色苷的研究較少，2000年Lu等在黑醋栗種子的70%丙酮提取液中發(fā)現(xiàn)了甲基吡喃花色苷[7]。2006年He等在陳釀葡萄酒中發(fā)現(xiàn)甲基吡喃花色苷，并經(jīng)質(zhì)譜和核磁鑒定首次證實(shí)了葡萄花色苷與乙酰乙酸反應(yīng)形成甲基吡喃花色苷[8]的機(jī)制。本文擬采用葡萄皮紅色素提取物（含大量錦葵花色苷malvidin-3-glucoside）在丙酮介質(zhì)中反應(yīng)合成甲基吡喃花色苷的技術(shù)路線，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件以methyl-pyranoMv的生成量為指標(biāo)，高效液相色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程，高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)-串聯(lián)離子阱多級(jí)質(zhì)譜法（HPLC-PDA-MS/MS）對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和確認(rèn)，為甲基吡喃花色苷的高效制備、花色苷的分子修飾及理化性質(zhì)和功能特性評(píng)價(jià)的深入研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

葡萄皮紅色素提取物（色價(jià)30） 購(gòu)于云南通海楊氏天然產(chǎn)物有限公司；甲基吡喃錦葵花色苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%） 波爾圖大學(xué)（University of Porto）化學(xué)學(xué)院；聚酰胺樹(shù)脂（60-100目） 上海摩速科學(xué)器材有限公司；乙腈、甲酸、甲醇等 均為高效液相色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇、丙酮、鹽酸、氫氧化鈉等 均為分析純，天津市永太化學(xué)試劑有限公司。

LTQ-XL超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo公司；SSI Series1500高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器） SSI公司；Lambda 25紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京譜朋科技有限公司；電子天平 梅特勒-托利多AL204；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士Buchi R-3；冷凍干燥機(jī) CHRIST ALPHA 2-4；超純水機(jī) 成都品成科技有限公司；水浴鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)機(jī)制 葡萄皮花色苷與丙酮在一定溫度和pH條件下反應(yīng)生成甲基吡喃花色苷，反應(yīng)機(jī)制見(jiàn)圖1。丙酮在一定的弱酸性pH條件下，β位碳先與α位碳發(fā)生烯醇化，隨后具有不同電荷特性的α位和β位碳與花色苷的C4位及C5位的羥基之間發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，經(jīng)脫水，氧化和脫羧，生成具有另外一個(gè)吡喃環(huán)的花色苷氧鎓離子[8]。

1.2.2 葡萄皮紅色素提取物中總花色苷的測(cè)定 采用pH示差法測(cè)定[9-11]花色苷含量。

圖1 甲基吡喃花色苷的形成機(jī)制Fig.1 The proposed formation mechanism of methyl pyranoanthocyanins

其中：A—在pH為1.0和pH為4.5處吸光度的差值；MW—cy-3-glu（矢車菊-3-葡萄糖苷）的相對(duì)分子質(zhì)量（449.4）；DF—稀釋倍數(shù)；ε—cy-3-glu的消光系數(shù)（26900）；l—比色皿光程1cm。

根據(jù)pH示差法測(cè)得的葡萄皮紅色素提取物中總花色苷的含量為102.99mg/g。

1.2.3 反應(yīng)產(chǎn)物中甲基吡喃花色苷含量及得率計(jì)算

利用高效液相色譜測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物中甲基吡喃花色苷的含量。

式中，X—樣品中甲基吡喃的濃度（mg/mL）；S1—樣品峰面積；C—甲基吡喃花色苷標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（mg/mL）；S2—甲基吡喃花色苷標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積

甲基吡喃花色苷得率（%）=實(shí)際生成量（mg）/理論生成量（mg）×100[12]

1.2.4 甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇反應(yīng)時(shí)間、葡萄皮紅色素提取物濃度、反應(yīng)溶液pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)物比例進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察不同條件對(duì)甲基吡喃花色苷合成效果的影響，以甲基吡喃花色苷得率為考察指標(biāo)。

1.2.4.1 反應(yīng)時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn) 葡萄皮紅色素提取物濃度為2.0mg/mL，葡萄皮紅色素提取物（mg）與丙酮（mL）的比例為20∶1，溫度45℃，pH為3.2，考察反應(yīng)時(shí)間為6、7、8、9、10d時(shí)對(duì)甲基吡喃花色苷合成效果的影響。

1.2.4.2 葡萄皮紅色素提取物濃度單因素實(shí)驗(yàn) 葡萄皮紅色素提取物（mg）與丙酮（mL）的比例為20∶1，溫度45℃，pH為3.2，考察葡萄皮紅色素提取物濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL時(shí)對(duì)甲基吡喃花色苷合成效果的影響。

1.2.4.3 pH單因素實(shí)驗(yàn) 葡萄皮紅色素提取物濃度為2.0mg/mL，葡萄皮紅色素提取物（mg）與丙酮（mL）的比例為20∶1，溫度45℃，考察不同pH（2.6、2.8、3.0、3.2、3.6）對(duì)甲基吡喃花色苷合成效果的影響。

1.2.4.4 溫度單因素實(shí)驗(yàn) 葡萄皮紅色素提取物濃度為2.0mg/mL，葡萄皮紅色素提取物（mg）與丙酮（mL）的比例為20∶1，pH3.2，考察不同溫度（30、35、40、45、50℃）對(duì)甲基吡喃花色苷合成效果的影響。

1.2.4.5 反應(yīng)物比例單因素實(shí)驗(yàn) 葡萄皮紅色素提取物濃度為2.0mg/mL，溫度45℃，pH為3.2，考察葡萄皮紅色素提取物（mg）與丙酮（mL）的比例為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1時(shí)甲基吡喃花色苷的合成效果。

正交實(shí)驗(yàn)：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平，按L9（34）正交表排列進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表設(shè)計(jì)如表1所示，每組設(shè)定3個(gè)重復(fù)組，優(yōu)化葡萄皮紅色素提取物與丙酮反應(yīng)合成甲基吡喃花色苷的參數(shù)。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Levels and factors table of orthogonal experiment

1.2.5 甲基吡喃花色苷的光譜特征 配制一定濃度的甲基吡喃花色苷水溶液，在300～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外可見(jiàn)全掃描，從而得出甲基吡喃花色苷色素的最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.6 甲基吡喃花色苷高效液相色譜分析[8]取產(chǎn)物溶液用SSI Series1500高效液相色譜檢測(cè)，色譜參考條件：LiChrospher RP-C18柱，250mm×4.6mm，5μm色譜柱。二極管陣列檢測(cè)器。流動(dòng)相：A為甲酸∶水（1∶9，v/v），B為乙腈∶甲酸∶水（8∶1∶1，v/v/v）。檢測(cè)波長(zhǎng)：478nm。進(jìn)樣量：20μL。流速：1mL/min。洗脫梯度：0～70min，B從15%線性增加到35%，70～75min，B增加到80%，之后沖洗系統(tǒng)10min。

1.2.7 甲基吡喃花色苷高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析花色苷與丙酮反應(yīng)液經(jīng)聚酰胺樹(shù)脂純化（?30×600mm，洗脫流速為1倍柱體積/小時(shí)），取10%酸化乙醇洗脫液洗脫出來(lái)的溶液進(jìn)行HPLC-MS測(cè)定。

HPLC參數(shù)：色譜柱：賽默反相C18色譜柱，100mm×2.1mm內(nèi)徑，1.9μm粒徑；檢測(cè)器：DAD檢測(cè)器；柱溫：25℃；流速：0.2mL/min；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：478nm。流動(dòng)相A：0.3%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：甲酸-乙腈-水（0.3∶80∶19.7）；洗脫梯度：0min，10%B；30min，20%B；35min，，100%B；45min，10%B。

MS設(shè)定的參數(shù)如下：ESI離子源；毛細(xì)管溫度為350℃；毛細(xì)管電壓為47V；N2：流速為30L/min，離子掃描范圍為100～1500（m/z），目標(biāo)離子531（m/z）。采用正離子掃描模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響甲基吡喃花色苷產(chǎn)物得率的單因素分析

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的影響在葡萄皮紅色素提取物濃度為2.0mg/mL，溫度45℃，pH為3.2，提取物與丙酮的比例為20∶1條件下，反應(yīng)時(shí)間對(duì)甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，甲基吡喃花色苷的生成量也逐漸增加，第9d時(shí)甲基吡喃花色苷生成量達(dá)最大值，隨后甲基吡喃花色苷含量開(kāi)始略微下降，可能是由于反應(yīng)物花色苷或生成物甲基吡喃花色苷在45℃下隨時(shí)間降解的原因。因此，最佳反應(yīng)時(shí)間為9d。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of reaction time on the yield of methyl pyranoanthocyanins

2.1.2 葡萄皮紅色素提取物濃度對(duì)甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的影響 花色苷反應(yīng)物濃度是影響合成反應(yīng)的關(guān)鍵因素，花色苷反應(yīng)物濃度對(duì)甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率有顯著影響。不同濃度葡萄皮紅色素提取物對(duì)甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響結(jié)果如圖3所示。當(dāng)提取物濃度由1mg/mL增加到2.5mg/mL時(shí)，隨著濃度的增加甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率也逐漸增加。當(dāng)濃度繼續(xù)增大時(shí)，甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率無(wú)增加趨勢(shì)甚至略微下降，故最適宜葡萄皮紅色素提取物濃度在2.5mg/mL左右。

圖3 葡萄皮紅色素提取物濃度對(duì)甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of concentration of extracts of red grape skins on the yield of methyl pyranoanthocyanins

2.1.3 pH對(duì)甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的影響 反應(yīng)體系的pH對(duì)甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，pH對(duì)甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的影響非常顯著，當(dāng)pH由2.6增大到3.0左右時(shí)，甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率先緩慢減小然后迅速增加，到3.0時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。隨著pH的繼續(xù)增大甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率隨之減小，當(dāng)pH大于3.6時(shí)，反應(yīng)幾乎不能進(jìn)行，產(chǎn)率接近于零。在溶液介質(zhì)中，花色苷隨pH的變化而發(fā)生結(jié)構(gòu)上的轉(zhuǎn)變[13]，這種轉(zhuǎn)變影響烯醇化的丙酮與花色苷的C4位及C5位的羥基之間發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)。由此可知，制備甲基吡喃花色苷的最佳反應(yīng)體系pH在3.0左右。

圖4 pH對(duì)甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of pH value on the yield of methyl pyranoanthocyanins

2.1.4 溫度對(duì)甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的影響 溫度與甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率有密切關(guān)系，不同溫度對(duì)甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，反應(yīng)溫度從30℃升高到35℃時(shí)甲基吡喃花色苷產(chǎn)率呈直線上升，隨后，隨著溫度的升高產(chǎn)率緩慢增加，45℃時(shí)到達(dá)最大。溫度繼續(xù)上升時(shí)產(chǎn)率降低，可能是由于溫度過(guò)高引起花色苷的部分降解。因此選取溫度45℃為反應(yīng)的最佳溫度。

圖5 溫度對(duì)甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率影響Fig.5 Effect of temperature on the yield of methyl pyranoanthocyanins

圖6 反應(yīng)物比例對(duì)甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率影響Fig.6 Effect of material-to-lipid ratio on the yield of methyl pyranoanthocyanins

2.1.5 反應(yīng)物比例對(duì)甲基吡喃花色苷合成反應(yīng)的影響 不同反應(yīng)物比例（葡萄皮紅色素提取物mg∶丙酮mL）對(duì)甲基吡喃花色苷產(chǎn)率的影響結(jié)果如圖6所示。當(dāng)反應(yīng)物比例由10∶1增加到20∶1時(shí)，甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率逐漸增加，繼續(xù)增加反應(yīng)物的比例時(shí)，甲基吡喃花色苷的產(chǎn)率呈下降趨勢(shì)。由此可知，制備甲基吡喃花色苷的最佳反應(yīng)物比例為20∶1。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment arrangement and results

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，以甲基吡喃花色苷的得率為指標(biāo)，由直觀分析法知：各因素從主到次的順序?yàn)椋海―）pH、（B）葡萄皮紅色素提取物濃度、（A）反應(yīng)物比例、（C）溫度，最優(yōu)方案為：A1B2C2D2，即反應(yīng)物比例為15∶1，底物濃度為2.5mg/mL，溫度為45℃，pH為3.0。由理論分析得到的優(yōu)化方案和正交表中的結(jié)果是一致的。在該反應(yīng)條件下甲基吡喃花色苷的得率為49.4%，高于表2中其他組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，A1B2C2D2為制備甲基吡喃花色苷的最佳反應(yīng)條件。

2.3 甲基吡喃花色苷的光譜特征

圖7 甲基吡喃花色苷色素的特征吸收光譜Fig.7 Visible absorption spectrum of the methyl-pyranoMv

甲基吡喃花色苷的紫外可見(jiàn)光譜如圖7所示，由圖7可知，甲基吡喃花色苷在478nm左右有一強(qiáng)吸收峰，與原花色苷最大吸收峰（524nm左右）相比，甲基吡喃花色苷的最大吸收波長(zhǎng)明顯發(fā)生了藍(lán)移，呈現(xiàn)黃色色澤。

2.4 反應(yīng)產(chǎn)物的高效液相色譜分析

圖8 花色苷反應(yīng)產(chǎn)物的高效液相色譜圖（530和478nm）Fig.8 HPLC chromatograms recorded at 530 and 478 nm of the reaction mixture of the anthocyanin-acetone adducts

圖8為高效液相色譜分析葡萄皮紅花色苷反應(yīng)生成甲基吡喃花色苷的色譜圖。由圖8可知，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)從530nm（花色苷的特征吸收波長(zhǎng)）變?yōu)?78nm時(shí)，保留時(shí)間23min處出現(xiàn)一新色譜峰A（如圖8峰A），結(jié)合其特征吸收光譜的掃描結(jié)果，初步判定峰A物質(zhì)為錦葵花色苷反應(yīng)形成的甲基吡喃花色苷。色譜圖還表明，在表2色譜分離條件下花色苷和甲基吡喃花色苷30min內(nèi)達(dá)到顯著的分離效果。

2.5 反應(yīng)主要產(chǎn)物高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果

高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)-串聯(lián)離子阱多級(jí)質(zhì)譜對(duì)初步純化后的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，其總離子流色譜圖（a）和主要目標(biāo)化合物的一級(jí)（b）、二級(jí)（c）質(zhì)譜圖如圖9所示。

由圖9可知，峰1的保留時(shí)間為32.26min，其最大吸收波長(zhǎng)為478nm，分子離子m/z為531，二級(jí)質(zhì)譜顯示分子離子m/z 531有一碎片離子m/z 369，它是失去一分子葡萄糖[M-162]+獲得，此結(jié)果與He等[8]的結(jié)果一致。Hayasaka等[14]曾對(duì)分子離子m/z 531的三級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行分析，根據(jù)失去的原子質(zhì)量分別為16、32、44、61、89amu可得出分子離子m/z 531的物質(zhì)為錦葵花色苷衍生物。Jingren he等[8]于2006年利用HPLC-MS及NMR等技術(shù)手段證實(shí)了錦葵花色苷與乙酰乙酸反應(yīng)生成的錦葵花色苷衍生物的結(jié)構(gòu)，即為甲基吡喃花色苷。綜上所述，根據(jù)特征吸收光譜表征和多級(jí)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)分析，確認(rèn)峰1物質(zhì)為錦葵花色苷與丙酮反應(yīng)生成的甲基吡喃花色苷。

3 結(jié)論

采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了制備甲基吡喃花色苷的最佳反應(yīng)條件，影響產(chǎn)物得率的主要因素依次是pH、葡萄皮紅色素提取物濃度、反應(yīng)物比例、反應(yīng)溫度?；ㄉ赵诒橘|(zhì)中反應(yīng)合成甲基吡喃花色苷的最佳條件為：反應(yīng)物比例（葡萄紅色素提取物mg∶丙酮mL）為15∶1，葡萄皮紅色素提取物濃度2.5mg/mL，反應(yīng)溫度45℃，體系pH為3.0，在該條件下，甲基吡喃花色苷產(chǎn)物得率為49.4%。利用高效液相色譜串聯(lián)離子阱多級(jí)質(zhì)譜結(jié)合特征吸收光譜分析鑒定了反應(yīng)主要產(chǎn)物為甲基吡喃錦葵花色苷。

圖9 花色苷與丙酮反應(yīng)生成物的HPLC-MS圖譜（a）、峰1的一級(jí)（b）和二級(jí)（c）質(zhì)譜圖Fig.9 HPLC-MS chromatograms（a）of the anthocyanin-acetone adducts and MS1（b）and MS2（c）fragmentation scheme for peak 1

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