張 靜 冉曉瀟 朱天輝 彭 艷 劉 洋

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，雅安，625014)

解淀粉芽孢桿菌對(duì)山茶灰斑病菌的抑制作用1)

張 靜 冉曉瀟 朱天輝 彭 艷 劉 洋

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，雅安，625014)

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)及其分泌物對(duì)山茶灰斑病病原菌茶褐斑擬盤(pán)多毛孢(Pestalotiopsisguepini(Desm.) Stey)具有較好的拮抗作用。采用正交試驗(yàn)法探究了碳源、氮源、pH值、溫度、接種量等因子對(duì)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)拮抗物質(zhì)的影響。結(jié)果表明：最佳碳、氮源分別為葡萄糖和蛋白胨。最佳優(yōu)化條件為25 ℃、蛋白胨0.3 g、葡萄糖0.5 g、pH值6.0、每125 mL接種2 mL孢子懸液于300 mL錐形瓶中震蕩培養(yǎng)?；谏L(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定，通過(guò)研究解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)時(shí)間與代謝產(chǎn)物拮抗活性的關(guān)系，得到解淀粉芽孢桿菌對(duì)茶褐斑擬盤(pán)多毛孢的最佳作用時(shí)間為72 h，抑菌值達(dá)0.85。

解淀粉芽孢桿菌；茶褐斑擬盤(pán)多毛孢；正交試驗(yàn)；抑菌活性

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-122～125

Bacillusamyloliquefaciensand its antagonistic substance can effectively antagonizePestalotiopsisguepini(Desm.) Stey. By orthogonal design method, we studyied the effects of varied factors on antagonistic substance producing ofB.amyloliquefaciens, including carbon source, nitrogen source, cultural pH, temperature, medium oxygen and inoculated volume. The optimal carbon source and nitrogen source were glucose and peptone, and the optimal fermentation conditions were with 28 ℃, pH of 7, peptone of 0.3 g, and 125 mL medium volume in 300 mL triangle flask bulk with 2 mL inoculating volume. By studying the growth curve and the relationship between culture time and antagonistic activities, we got the bactriostatic effect ofB.amyloliquefaciensonP.guepini, and when the optimal reaction time was 72 h, the inhibiting rate was up to 85%.

KeywordsBacillusamyloliquefaciens; Fermentation condition; Orthogonal trial; Antifungal activity

山茶(Camelliajaponica)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中易受多種病原菌侵染[1-2]，其中由茶褐斑擬盤(pán)多毛孢(Pestalotiopsisguepini(Desm.) Stey)侵染所致山茶灰斑病發(fā)生十分普遍，極大危害山茶的觀(guān)賞價(jià)值，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是從山茶組織內(nèi)分離得到的一種內(nèi)生拮抗細(xì)菌，對(duì)該病原菌具有明顯的抑制作用。但目前對(duì)山茶灰斑病的研究?jī)H限于病原菌生物學(xué)特性[5]及化學(xué)防治[6]方面，對(duì)利用寄主內(nèi)生拮抗細(xì)菌防治山茶灰斑病方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。芽孢桿菌屬是一類(lèi)能夠產(chǎn)生抗逆性?xún)?nèi)生孢子、低分子抗生素[7]以及抗菌蛋白多肽類(lèi)活性物質(zhì)[8]的桿狀細(xì)菌，對(duì)多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用[9-12]，因而被廣泛應(yīng)用于生防制劑的研究[13]。目前，對(duì)于芽孢桿菌屬的生防研究主要集中在枯草芽孢桿菌[14-15]、蠟狀芽孢桿菌[16]、多粘芽孢桿菌[17]等，對(duì)解淀粉芽孢桿菌高產(chǎn)抗菌物質(zhì)和生防特性方面的研究還不夠完善。就此，本研究以解淀粉芽孢桿菌為研究對(duì)象，對(duì)其培養(yǎng)基最佳碳、氮源和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，對(duì)其抗病機(jī)制和抑菌成效進(jìn)行研究，旨在為該菌抑菌活性物質(zhì)的鑒定、生防制劑開(kāi)發(fā)，及山茶灰斑病的生物防治提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

拮抗菌為解淀粉芽孢桿菌BA10菌株，病原菌為茶褐斑擬盤(pán)多毛孢菌，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2 樣品制備

①拮抗菌發(fā)酵液：接種解淀粉芽孢桿菌于斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后用無(wú)菌水洗下，25 ℃，140 r/min，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)72 h，待用。②無(wú)菌濾液：取發(fā)酵液，10 000 r/min，4 ℃，離心10 min，棄沉淀，得上清液，后用0.22 μL細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾得到病原菌無(wú)菌濾液。③病原菌菌餅：將活化的茶褐斑擬盤(pán)多毛孢菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，2～3 d后用打孔器打孔(直徑為5 mm)得菌餅，待用。

1.3 抗菌活性的測(cè)定

取2 mL無(wú)菌濾液于培養(yǎng)皿中，另取融化且冷卻45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基20 mL倒入其中，充分混勻后靜置，待培養(yǎng)基冷卻后，接入菌餅，平放于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)，用十字交叉法分別測(cè)定第4天，第5天菌落直徑，不加培養(yǎng)液為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算抑菌值。抑菌值=相對(duì)菌落直徑/對(duì)照菌落直徑。

1.4 解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)條件的篩選

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，碳源分別選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖(用量0.5%)；氮源分別選用(NH4)2SO4、NH4NO3、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏(用量0.1%)。室溫下，300 mL三角瓶裝150 mL培養(yǎng)基，分別接種2 mL解淀粉芽孢桿菌種子液，140 r/min震蕩培養(yǎng)72 h，設(shè)計(jì)2因素5水平正交試驗(yàn)L20(52)進(jìn)行優(yōu)化，每處理重復(fù)3次，確定培養(yǎng)基最佳碳、氮源。

1.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

根據(jù)優(yōu)化后的碳、氮源培養(yǎng)基，采用正交表L25(56)(表1)設(shè)計(jì)6因素5水平的正交試驗(yàn)進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，選擇最優(yōu)培養(yǎng)條件，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，以B.amyloliquefaciens對(duì)P.guepini的抑菌值為結(jié)果檢驗(yàn)指標(biāo)[18]。參照1.3進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。

表1 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵條件的試驗(yàn)因子及水平

注：培養(yǎng)條件140 r/min，72 h。

1.6 解淀粉芽孢桿菌生長(zhǎng)量與代謝產(chǎn)物抑菌作用的關(guān)系

生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定：以最優(yōu)方案搖床培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌63瓶，3組重復(fù)，每組21瓶，接種開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔6 h取一瓶，在波長(zhǎng)650 nm處測(cè)各無(wú)菌發(fā)酵液OD值，接菌初始時(shí)OD 值為對(duì)照，直至測(cè)完21瓶，最后以發(fā)酵時(shí)間為橫軸，以3組無(wú)菌發(fā)酵液OD650平均值為縱軸作生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

抑菌活性曲線(xiàn)的制作：離心取上層清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原來(lái)的1/2，后用細(xì)菌過(guò)濾器抽濾制成無(wú)菌代謝產(chǎn)物，取2 mL制成含藥平板，接種菌餅后測(cè)定解淀粉芽孢桿菌對(duì)茶褐斑擬盤(pán)多毛孢的抑菌作用，接菌初始時(shí)OD值為對(duì)照，直至測(cè)完21瓶，最后以發(fā)酵時(shí)間為橫軸，以3組無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌均值為縱軸作抑菌活性曲線(xiàn)，與生長(zhǎng)曲線(xiàn)對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)拮抗物質(zhì)的最佳碳、氮源

由表2可知，不同的碳、氮源組合對(duì)解淀粉芽孢桿菌抑菌效果的影響呈顯著性差異。接種菌餅后第2天，P.guepini呈不同趨勢(shì)生長(zhǎng)，部分菌生長(zhǎng)幅度與對(duì)照等同，但菌絲明顯萎縮變形；部分菌只長(zhǎng)到培養(yǎng)皿1/2半徑處便停止生長(zhǎng)，且菌絲肉眼辨別不明顯；更有部分菌餅處逐漸變黑，幾乎無(wú)菌落增長(zhǎng)。方差分析(表2)可知，解淀粉芽孢桿菌在葡萄糖和蛋白胨處理時(shí)無(wú)菌濾液對(duì)P.guepini的拮抗效果最好，抑菌值達(dá)到0.81，而乳糖和NH4NO3處理時(shí)無(wú)菌濾液的拮抗效果最差，為0.13。由此得出，解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)拮抗物質(zhì)的最佳碳、氮源分別為葡萄糖和蛋白胨。

表2 解淀粉芽孢桿菌碳、氮源篩選試驗(yàn)結(jié)果及顯著性

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫(xiě)字母者表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)拮抗物質(zhì)的最佳發(fā)酵條件

以篩選出的最優(yōu)培養(yǎng)基組分為基礎(chǔ)，在25組解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)基發(fā)酵條件下的抑菌值分別為：0.596±0.053、0.860±0.031、0.484±0.077、0.518±0.039、0.563±0.046、0.658±0.004、0.651±0.021、0.567±0.043、0.834±0.022、0.645±0.008、0.559±0.066、0.574±0.036、0.586±0.021、0.429±0.047、0.464±0.042、0.676±0.065、0.156±0.016、0.446±0.085、0.184±0.035、0.193±0.026、0.154±0.019、0.207±0.087、0.229±0.090、0.164±0.062、0.160±0.06。極差分析結(jié)果見(jiàn)表3。在L25(56)正交試驗(yàn)中，每個(gè)因子均作5個(gè)區(qū)組處理，溫度T2區(qū)組(25 ℃)的抑菌總值最大(10.068)，T5區(qū)組(40 ℃)抑菌總值最小(2.746)，因此，判斷25 ℃為解淀粉芽孢桿菌拮抗效果的最適溫度；同理，pH區(qū)組T1的抑菌總值顯著高于其他區(qū)組，6.0為最佳pH值；T4區(qū)組125 mL為最佳瓶裝量；T2區(qū)組2 mL為最佳接種量；而T2、T3區(qū)組的0.5 g/L和0.3 g/L為最適碳源、氮源。通過(guò)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的極差(表3)和方差分析(表4)可知，各因素對(duì)解淀粉芽孢桿菌的拮抗效果的影響差異極顯著，在培養(yǎng)條件范圍內(nèi)，影響解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)拮抗物質(zhì)最主要的因素是溫度，其次是接種量、碳源和pH。

根據(jù)表3綜合得出，25 ℃條件下，pH值6.0，蛋白胨0.3 g，葡萄糖0.5 g，接種量2 mL，每125 mL接種2 mL孢子懸液于300 mL錐形瓶中振蕩培養(yǎng)時(shí)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)拮抗物質(zhì)的抑菌效果最好。在此發(fā)酵條件下，解淀粉芽孢桿菌無(wú)菌代謝產(chǎn)物對(duì)茶褐斑擬盤(pán)多毛孢的抑菌值高達(dá)0.85，菌落增長(zhǎng)幅度明顯受到抑制，菌絲肉眼無(wú)法辨認(rèn)。由此得知，該條件即為解淀粉芽孢桿菌高產(chǎn)拮抗物質(zhì)的最佳發(fā)酵條件。

表3 解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)基發(fā)酵條件極差分析結(jié)果

注：T為各指標(biāo)總和。

表4 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵條件方差分析結(jié)果

注：** 為P<0.01；*為P<0.05；F0.05(4,70)=2.5；F0.01(4,70)=3.6。

2.3 解淀粉芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)及抗菌曲線(xiàn)

結(jié)合生長(zhǎng)曲線(xiàn)及抑菌作用曲線(xiàn)可知，0～24 h抑制效果緩慢加強(qiáng)，但抑制率均低于0.10，此時(shí)菌體生長(zhǎng)緩慢；24～72 h由于菌體生長(zhǎng)迅速，抑菌活性也大幅度增強(qiáng)；72 h抑菌活性達(dá)到最高峰，解淀粉芽孢桿菌拮抗產(chǎn)物對(duì)P.guepini的抑制率高達(dá)0.85；72 h后由于解淀粉芽孢桿菌生長(zhǎng)開(kāi)始衰退，因此抑菌作用也急劇下降。由此得出，解淀粉芽孢桿菌對(duì)P.guepini的抑菌作用強(qiáng)度隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后緩慢下降規(guī)律，最佳作用時(shí)間為接種后的72 h(圖1)。

3 結(jié)論與討論

解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生具有抗菌作用的低分子量抗生素及抗菌脂肽類(lèi)活性物質(zhì)[19]。但其所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)易受外部環(huán)境影響，不同環(huán)境條件可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種脂肽代謝產(chǎn)物[20]，因此研究培養(yǎng)基碳、氮源組成成分和發(fā)酵條件的選擇對(duì)于提高解淀粉芽孢桿菌高效生產(chǎn)拮抗物質(zhì)意義重大。

培養(yǎng)基成分優(yōu)化試驗(yàn)表明，葡萄糖和蛋白胨是解淀粉芽孢桿菌最適宜的碳、氮源，不同碳、氮源組合對(duì)菌株生長(zhǎng)影響顯著，這與Caldeira等的結(jié)論[21]一致。而麥芽糖和蛋白胨組合對(duì)病原菌也具有明顯的抑制作用，但由于麥芽糖的價(jià)格過(guò)高，與大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及市場(chǎng)需求原則相悖，故不作考慮[22]。此外，解淀粉芽孢桿菌對(duì)培養(yǎng)溫度、pH、接種量、瓶裝量等因子要求較高。方差分析表明，最佳優(yōu)化條件皆與其它水平呈顯著性差異，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件顯著提高了解淀粉芽孢桿菌的抑菌活性，使得茶褐斑擬盤(pán)多毛孢菌落生長(zhǎng)受到阻礙，明顯抑制了菌絲的萌發(fā)和分生孢子的產(chǎn)生，達(dá)到防治山茶灰斑病的效果。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間與代謝產(chǎn)物抗菌活性及生長(zhǎng)趨勢(shì)的關(guān)系

解淀粉芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)和抑菌活性曲線(xiàn)表明，解淀粉芽孢桿菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)與其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)數(shù)量具有一定的關(guān)系，即其抗菌活性高低與生長(zhǎng)速率呈正相關(guān)，在72 h同時(shí)達(dá)到生長(zhǎng)及抗菌活性峰值，之后隨著菌體衰退、分解甚至死亡等自身?xiàng)l件限制而表現(xiàn)為菌株生產(chǎn)的降低，但究竟是代謝產(chǎn)物的作用或是其他作用還有待進(jìn)一步研究。

解淀粉芽孢桿菌作為一種極具開(kāi)發(fā)前景的生防菌，具有生長(zhǎng)速度快，代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高，抑菌活性強(qiáng)，培養(yǎng)條件易掌握，對(duì)多種病害具有明顯防治效果等優(yōu)點(diǎn)[23]。本試驗(yàn)所得出的結(jié)論進(jìn)一步證明了解淀粉芽孢桿菌的生防潛力，也為該菌的生防開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供了重要參考價(jià)值，為山茶灰斑病的生物防治提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)，但目前有關(guān)解淀粉芽孢桿菌的拮抗機(jī)理、拮抗物質(zhì)(抗生素、抗菌脂肽類(lèi)等)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的研究未見(jiàn)報(bào)道，有待于進(jìn)一步探究。

[1] 陳宗懋,陳雪芬.茶樹(shù)病害的診斷和防治[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1989.

[2] 譚濟(jì)才,葉恭銀,高旭暉,等.茶樹(shù)病蟲(chóng)防治學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2002.

[3] Garibaldi A, Gilardi G, Bertetti D, et al. Proof for the occurrence of flower blight caused byCiboriniacamelliaein Italy[J]. Plant Disease,2001,85(8):924.

[4] 李根盛,梁健怡,游國(guó)標(biāo),等.山茶花灰斑病的發(fā)生與綜合防治方法[J].中國(guó)農(nóng)技推廣,2004,9(2):54-55.

[5] 邢勇,何定萍.山茶花灰斑病菌生物學(xué)特性研究[J].植物病理學(xué)報(bào),1990,20(3):161-166.

[6] 葛起新,徐同,孫小桉,等.山茶灰斑病病原菌斑污擬盤(pán)多毛孢的研究[J].真菌學(xué)報(bào),1993,12(3):200-204.

[7] Chen Xiaohua, Koumoutsi A, Scholz R, et al. Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacteriumBacillusamyloliquefaciensFZB42[J]. Nature Biotechnology,2007,25(9):1007-1014.

[8] Yu G Y, Sinclair J B, Hartman G L, et al. Production of iturin A byBacillusamyloliquefacienssuppressingRhizoctoniasolani[J]. Soil Biology and Biochemistry,2002,34(7):955-963.

[9] Hiradate S, Yoshida S, Sugie H, et al. Mulberry anthracnose antagonists (iturins) produced byBacillusamyloliquefaciensRC-2[J]. Phytochemistry,2002,61(6):693-698.

[10] 陳志誼,許志剛,高泰東,等.水稻紋枯病拮抗細(xì)菌的評(píng)價(jià)與利用[J].中國(guó)水稻科學(xué),2000,14(2):98-102.

[11] 張君成,陳志誼,張炳欣,等.稻曲病菌的形態(tài)學(xué)觀(guān)察研究[J].植物病理學(xué)報(bào),2003,33(6):517-523.

[12] 葉云峰,黎起秦,袁高慶,等.枯草芽孢桿菌B47菌株高產(chǎn)抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報(bào),2011,38(9):1339-1346.

[13] Emmert E A B, Handelsman J. Biocontrol of plant disease: a (Gram-) positive perspective[J]. FEMS Microbiology Letters,1999,171(1):1-9.

[14] Touré Y, Ongena M, Jacques P, et al. Role of lipopeptides produced byBacillussubtilisGA1 in the reduction of grey mould disease caused byBotrytiscinereaon apple[J]. Journal of Applied Microbiology,2004,96(5):1151-1160.

[15] 王帥,高圣風(fēng),高學(xué)文,等.枯草芽孢桿菌脂肽類(lèi)抗生素發(fā)酵和提取條件[J].中國(guó)生物防治,2007,23(4):342-347.

[16] 李柏青,朱育菁,張賽群,等.蠟狀芽孢桿菌對(duì)番茄青枯雷爾氏菌致病性的影響[J].廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,46(4):574-577.

[17] 趙德立,曾林子,李暉,等.多粘芽孢桿菌JW-725抗菌活性物質(zhì)及其發(fā)酵條件的初步研究[J].植物保護(hù),2006,32(1):47-50.

[18] 沈光斌,周明國(guó).水稻白葉枯病菌對(duì)噻枯唑的抗藥性監(jiān)測(cè)[J].植物保護(hù),2002,28(1):9-11.

[19] Yoshida S, Hiradate S, Tsukamoto T, et al. Antimicrobial activity of culture filtrate ofBacillusamyloliquefaciensRC-2 isolated from mulberry leaves[J]. Phytopathology,2001,91(2):181-187.

[20] 鄧建良,劉紅彥,劉玉霞,等.解淀粉芽孢桿菌YN-1抑制植物病原真菌活性物質(zhì)鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào),2010,40(2):202-209.

[21] Caldeira A T, Feio S S, Arteiro J M S, et al. Environmental dynamics ofBacillusamyloliquefaciensCCMI 1051 antifungal activity under different nitrogen patterns[J]. Journal of Applied Microbiology,2008,104(3):808-816.

[22] 劉玉梅,徐麗,劉郁,等.真菌生防制劑的生產(chǎn)、劑型加工及穩(wěn)定性研究[J].世界農(nóng)藥,2007,29(6):35-41.

[23] 陳中義,張杰,黃大昉.植物病害生防芽孢桿菌抗菌機(jī)制與遺傳改良研究[J].植物病理學(xué)報(bào),2003,33(2):97-103.

BacillusamyloliquefaciensAntimicrobial Effect onPestalotiopsisguepini(Desm.) Stey/

Zhang Jing, Ran Xiaoxiao, Zhu Tianhui, Peng Yan, Liu Yang(Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, P. R. China)//

1) 國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目(2005DK21207-13)。

張靜，女，1990年4月生，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。

朱天輝，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail：zhuth1227@tom.com。

2013年10月23日。

S476.11

責(zé)任編輯：程 紅。