余 琴 朱天輝 李姝江 安曉龍

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，雅安，625000)

耐福美雙桑氏鏈霉菌生物型的選育1)

余 琴 朱天輝 李姝江 安曉龍

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，雅安，625000)

為選育抗藥性桑氏鏈霉菌(Streptomycessampsonii)，采用紫外線照射與藥物培養(yǎng)基馴化結(jié)合法，篩選出MV-1、MV-2、MV-3、MV-4、MV-5等5株能在含有200 mg/L福美雙的培養(yǎng)基上生長的抗性突變株。結(jié)果顯示：出發(fā)原菌株KJ40對福美雙最敏感，EC50為12.82 mg/L，致死濃度為40 mg/L。5株突變株中，MV-2和MV-5的EC50值最高，為129.28 mg/L，抗性水平最高，達(dá)10.09；MV-1最低，EC50為100.13 mg/L，抗性水平7.81。通過抑菌效果測定發(fā)現(xiàn)，MV-2和MV-4對紫絲核菌(Rhizoctoniacrocorum)抑菌力顯著高于KJ40，抑菌率為80.39%和76.08%，分別比KJ40提高了10.59%和6.28%；MV-5無抑菌效果；MV-1和MV-3對病原菌的抑菌效果與KJ40無顯著差異。拮抗活性高于親本的MV-2和MV-4與福美雙協(xié)同使用，抑菌效果高于菌株和福美雙藥液單獨使用。

桑氏鏈霉菌；抗福美雙；紫外線誘變

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-133～136，142

We screened out five mutation strains resistant to thiram of MV-1, MV-2, MV-3, MV-4 and MV-5 by the combination methods of UV irradiation and medical cultivation to select the thiram-resistant mutants ofStreptomycessampsonii. Among the tested strains ofStreptomycessampsonii, KJ40 was the most sensitive to thiram, the EC50was 12.82 μg/mL, the lethal concentration was 40 μg/mL. The resistant level of MV-2 and MV-5 were the highest between the thiram-resistant strains, and the EC50and the resistant level were 129.28 μg/mL and 10.09, respectively. The resistance level of MV-1 was the lowest, and the EC50and the resistant level were 100.13 μg/mL and 7.81, respectively. By determining inhibiting effect, inhibition activities of MV-2 and MV-4 were more significant than their parental strains, and the inhibition rate reached 80.39% and 76.08%, respectively. Compared with KJ40, the inhibition rates were improved by 10.59% and 6.28%, respectively. MV-5 had no antibacterial effect onRhizoctoniacrocorum. Compared with the parental strains, there were no significant changes in inhibition activities of mv-1 and mv-3. By using the mixed of Thiram and Thiram-resistant mutants with the strongest inhibition activity, the inhibiting effect was more than that of thiram-resistant mutantsor and thiram alone.

KeywordsStreptomycessampsonii; Thiram-resistant; Mutation by UV irradiation

隨著近代對化學(xué)農(nóng)藥的過度依賴，很多病原真菌對化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了強烈的抗藥性，更進(jìn)一步導(dǎo)致了化學(xué)農(nóng)藥的濫用，對全球的環(huán)境健康和食品安全構(gòu)成了巨大威脅。目前，應(yīng)用生物防治控制植物病害已經(jīng)越來越受到世界各國的重視，篩選有益微生物、由生防微生物開發(fā)的農(nóng)藥已成為國內(nèi)外生物防治研究的熱點。但能夠?qū)嶋H應(yīng)用到植物病害防治上的還很少。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)實驗室從楊樹根系分離得到了一株對楊樹紫絲核菌(Rhizoctoniacrocorum)有抑制作用的StreptomycessampsoniiKJ40[1]。國內(nèi)對桑氏鏈霉菌的研究較少，Jain等[2]從花園的土壤中分離得到具有抗真菌活性桑氏鏈霉菌菌株。野生鏈霉菌株對農(nóng)藥的抗藥性差，當(dāng)施用農(nóng)藥后對具生防作用的菌株也有殺滅效果，造成生防作用下降或者無明顯生防作用。報道顯示[3]，生防菌和化學(xué)農(nóng)藥混合使用，不僅可以降低農(nóng)藥的使用量，減輕對環(huán)境的污染，還因為化學(xué)殺菌劑的使用削弱了病原菌的生長，使其對生防菌更加敏感，從而提高了生防菌的防治效果。實現(xiàn)生防菌和化學(xué)農(nóng)藥綜合利用的前提是生防菌對化學(xué)農(nóng)藥要有一定的耐藥性。本研究采用紫外線照射與藥物培養(yǎng)基馴化相結(jié)合的方法，選育對福美雙具有抗性的桑氏鏈霉菌突變菌株，通過篩選獲得抗福美雙突變株，并對抗福美雙突變株的生防特性進(jìn)行了分析研究，為突變菌株在生產(chǎn)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

桑氏鏈霉菌KJ40菌株(以下簡稱鏈霉菌KJ40)和楊樹紫紋羽病病原菌紫絲核菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)實驗室提供。40%福美雙可濕性粉劑購自山東濰坊萬盛生物農(nóng)藥有限公司。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于放線菌的培養(yǎng)，其配比為葡萄糖10 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、瓊脂粉20 g、NaC 15 g、水1 L，pH=7.0～7.2。PDA培養(yǎng)基用于拮抗性測定，其配比為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 L，pH自然。

福美雙對鏈霉菌孢子致死濃度的測定：鏈霉菌KJ40斜面25 ℃培養(yǎng)2 d，將其制備成106～107個/mL的孢子懸液。取1 mL制備好的出發(fā)菌株孢子懸液分別涂布于含福美雙1、5、10、50、100、200 mg/L的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，以不加福美雙的處理為對照，置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)。2 d后逐日觀察記載菌落的生長情況。凡是在前一個低濃度平板上長出菌落而在后一個較高濃度平板上未長出菌落的，后一濃度即為福美雙對出發(fā)菌株孢子的致死濃度[4]。

紫外線誘變：將出發(fā)菌株接種于斜面牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)活化2 d，將其制備成孢子懸液。取1 mL菌懸液按照梯度稀釋法[5]稀釋為10-3、10-4、10-5。吸取不同稀釋梯度的菌懸液分別涂布在平板上，于30 W紫外燈下誘變30 s。25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d后計算菌落數(shù)，以未經(jīng)紫外線誘變菌株的涂布培養(yǎng)結(jié)果為對照，統(tǒng)計菌落數(shù)，計算紫外誘變后的致死率，確定最佳的誘變菌懸稀釋液濃度。將確定的最佳誘變濃度菌懸液吸取1 mL涂布在平板上，30 W紫外燈下誘變10、20、30、60、120 s，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d后計算菌落數(shù)。試驗以不進(jìn)行紫外誘變的平板為對照，并以致死率在60%～90%[6]確定最佳誘變時間。

抗福美雙突變株的篩選：將突變株接入斜面進(jìn)行培養(yǎng)保存。再將得到的突變株平板劃線培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入斜面2～3 d，將其制備成孢子懸液。吸取1 mL制備好的孢子懸液分別涂布于含福美雙40 mg/L的培養(yǎng)基平板上，30 W紫外燈下誘變30 s，每處理重復(fù)3次，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d后計算菌落數(shù)。3 d后逐日觀察記載菌落生長情況。凡是在平板上長出菌落的，即為抗福美雙40 mg/L的突變菌株。如此反復(fù)，逐步提高藥劑濃度直到在福美雙200 mg/L的長出菌株。計算菌落數(shù)并將單菌落挑接于斜面上，25 ℃培養(yǎng)，待斜面孢子豐滿，置于冰箱中，4 ℃保存。

抗性突變株對福美雙的抗性水平測定：將原KJ40菌株和5株突變株制成孢子懸液，取1 mL到含福美雙10、20、30、40、50、100、150、200 mg/L的牛肉膏蛋白胨平板上[7]，置于恒溫箱中，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。4 d后通過菌落計數(shù)法計數(shù)[8]，以不加福美雙的處理為對照，每個處理重復(fù)3次。通過抑菌率值和各有效藥劑濃度對數(shù)值之間的線性回歸分析[9]，求出各菌株的EC50值。以敏感菌株KJ40為對照?？剐酝蛔凅w的抗性水平=抗性突變體的EC50值/敏感菌株KJ40的EC50值。

抗福美雙突變株對楊樹紫絲核菌的抑菌效果：通過平板對峙法[6]測定出KJ40和突變菌株的抑菌效果。在直徑90 mm的PDA平板中心接種活化后的直徑5 mm的紫絲核菌，在PDA平板距中心25 mm對稱的4點接種直徑5 mm的KJ40和抗福美雙的突變菌株。25 ℃培養(yǎng)5 d后，觀察記錄抑菌情況，測定抑菌帶寬度，3次重復(fù)。

福美雙和突變株協(xié)同對紫絲核菌的抑菌效果：將KJ40和突變菌株在福美雙50 mg/L PDA平板距中心25 mm對稱的兩側(cè)劃線培養(yǎng)。以不加福美雙藥液單獨處理為對照。菌絲生長抑制率=((對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑)×100%。式中，菌落直徑=測量菌落直徑-5.0。

抗性突變株的遺傳穩(wěn)定性：將經(jīng)過福美雙誘變獲得的具有抑菌作用的抗性突變株繼代轉(zhuǎn)管10次以上，再轉(zhuǎn)移至含200 mg/L福美雙的平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，2～3 d后觀察對福美雙抗性的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 福美雙對鏈霉菌孢子的致死濃度

由表1可知，福美雙對菌株KJ40孢子的致死濃度為40 mg/L，以此為菌株KJ40抗藥性致死突變標(biāo)志。將在40 mg/L長出的5株耐藥菌株平板劃線培養(yǎng)后保存。

表1 福美雙對菌株KJ40孢子的致死濃度

2.2 紫外線誘變

2.2.1 最適菌體稀釋濃度

以菌株KJ40為出發(fā)菌株，對其不同濃度的菌懸液進(jìn)行30 W紫外燈下30 s誘變，誘變結(jié)果見表2。由表2可知，隨著菌懸液濃度的降低，致死率逐漸升高，由于高劑量可能造成更多負(fù)突變株，所以選擇致死率為60%～90%的劑量誘變。因此，確定最適的誘變菌懸液稀釋濃度為10-3。

表2 不同稀釋濃度菌懸液的紫外線誘變結(jié)果

2.2.2 最適誘變時間

以菌懸液稀釋濃度10-3為最適誘變濃度，進(jìn)行30 W紫外燈下不同時間誘變，誘變時間與菌落數(shù)變化關(guān)系如表3所示。由表3可知，隨著誘變時間的增長，存活菌落數(shù)逐漸減少，致死率逐漸增加，依據(jù)致死率為60%～90%，確定最適誘變時間為30 s，此時致死率為85.38%。

表3 紫外線誘變時間對菌懸液的影響

2.3 抗福美雙突變株的篩選

通過紫外線誘變與藥劑馴化相結(jié)合的方法對親本桑氏鏈霉菌菌株KJ40進(jìn)行反復(fù)誘導(dǎo)，最終得到5個能在福美雙質(zhì)量濃度為200 mg/L的培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)孢的突變菌株(圖1)。突變株外部形態(tài)無較大變化，但在含藥平板上菌落數(shù)變少且生長速度變緩，4d后才開始生長。將篩選出的突變株命名為ΜV-1、ΜV-2、ΜV-3、ΜV-4、ΜV-5，在含藥200 mg/L平板上分別生長出菌落數(shù)為46.67±7.50、380.67±89.37、213.67±24.58、10.00±8.02、211.00±12.53，KJ40無菌落生長。

1.KJ40；2.MV-3；3.KJ40的孢子，×400；4.MV-3的孢子，×400；5.MV-2的孢子，×400；6.MV-4的孢子，×400。

圖1 福美雙200 mg/L質(zhì)量濃度下菌株生長情況

2.3.1 突變株對福美雙的抗性水平

將KJ40和突變株對福美雙進(jìn)行抗性水平測定。結(jié)果表明(表4)，KJ40的EC50值為12.82 mg/L，和抗福美雙突變株的EC50值存在顯著差異。在抗性突變株中，MV-2和MV-5的EC50值最大，為129.28 mg/L，其次是MV-3，EC50為124.50 mg/L。MV-1的EC50值最小，為100.13 mg/L。以親本KJ40菌株為敏感對照菌株，以各抗性突變株的EC50值與親本對照菌株的EC50值之比計算了各抗福美雙突變株的抗性水平。結(jié)果顯示，MV-2和MV-5的抗性水平最高，達(dá)到10.09，其次是MV-3，抗性水平為9.71，抗性水平最低的是MV-1，抗性水平為7.81。

表4 桑式鏈霉菌不同突變株對福美雙的抗性水平

注：采用Duncan多重比較法分析，同一列不同字母表示差異顯著(P<0.05，n=3)。

2.3.2 突變株對楊樹紫絲核菌的抑菌效果

通過紫外線誘變和藥劑馴化后，拮抗菌對楊樹紫紋羽病菌的拮抗效果發(fā)生顯著變化(表5)。有的突變株拮抗活性減弱，如ΜV-5，對楊樹紫紋羽病菌無抑制效果；有的突變株對菌絲的拮抗活性無顯著變化，如ΜV-1和ΜV-3。有的突變株拮抗活性增強，如ΜV-2的抑菌率80.39%與KJ40的69.80%相比，提高了10.59%；MV-4提高了6.28%，提高了抑菌效果。選擇防效最好的MV-2、MV-4突變株研究其與福美雙對紫絲核菌的協(xié)同作用。

表5 抗藥性桑氏鏈霉菌對楊樹紫紋羽病菌的抑制效果

注：病原菌菌落直徑數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Duncan多重比較法分析，同一列不同字母表示差異顯著(P<0.05，n=3)。

福美雙和MV-2、MV-4協(xié)同對紫絲核菌的抑菌效果見圖2。親本KJ40無法在福美雙50 mg/L平板上生長。紫絲核菌在50 mg/L含藥平板上基本無法拓展生長(圖2e)。在MV-2、MV-4和福美雙協(xié)同作用時，紫絲核菌無法生長(圖2f和圖2g)。結(jié)果表明，福美雙和鏈霉菌協(xié)同使用對紫絲核菌的抑菌作用與單獨使用鏈霉菌和福美雙藥液有明顯提高。

a.楊樹紫紋羽病菌在不含藥平板上的生長情況；b.KJ40對楊樹紫紋羽病菌的抑菌效果；c.MV-4對楊樹紫紋羽病菌的抑菌效果；d.MV-2對楊樹紫紋羽病菌的抑菌效果；e.楊樹紫紋羽病菌在50 mg/L含藥平板上的生長情況；f.MV-4在50 mg/L含藥平板上對楊樹紫紋羽病菌的抑制效果；g.MV-2在50 mg/L含藥平板上對楊樹紫紋羽病菌的抑制效果。

圖2 不同菌株對楊樹紫紋羽病菌的抑菌情況

2.3.3 突變株的遺傳穩(wěn)定性

將經(jīng)過福美雙誘變獲得的抗性突變株繼代轉(zhuǎn)管10次以上，再轉(zhuǎn)移至含福美雙50、100、150、200 mg/L的平板上，突變株菌落均能夠生長和產(chǎn)孢，且對病原菌的抑制效果不變。這說明突變株的抗藥性和拮抗性較為穩(wěn)定和持久。

3 結(jié)論與討論

由于各種誘變劑對微生物的作用位點和方式不盡相同，因此，反復(fù)使用同一誘變因子會出現(xiàn)鈍化現(xiàn)象，可能引起微生物的回復(fù)突變。在鏈霉菌的誘變育種上，采用兩種或兩種以上的方式進(jìn)行誘變育種已經(jīng)取得了很好的效果[10-12]。本試驗通過紫外線誘變和含藥培養(yǎng)基馴化相結(jié)合的方法，具有一定的方向性(抗藥性)，篩選出對福美雙高抗的突變性菌株。通過親本KJ40菌株和突變菌株做抗性水平測定，KJ40的致死濃度為40 mg/L福美雙藥液，EC50值為12.82 mg/L；各突變株能在200 mg/L上長出菌落，EC50值100.13～128.28 mg/L，突變株對KJ40抗性水平為7.81～10.09，其中抗性水平最高的為MV-2和MV-5達(dá)到了10.09。說明通過紫外線誘變和含藥培養(yǎng)基馴化相結(jié)合的方法可以明顯提高鏈霉菌的抗藥性。繼代轉(zhuǎn)管10次以上，再轉(zhuǎn)移至含藥平板上，突變株菌落均能夠生長和產(chǎn)孢，且對病原菌的抑制效果不變。這說明突變株的抗藥性和拮抗性較為穩(wěn)定和持久。

絕大多數(shù)的高產(chǎn)抗生素產(chǎn)生菌都使用過紫外線誘變育種，且有很好的效果[13-15]。但對拮抗菌生物活性的影響卻是隨機的，有的抑制作用增強，有的抑制作用減弱甚至沒有抑制作用。如ΜV-2與KJ40的抑菌率相比，提高了10.59%，MV-5無抑菌效果。

實現(xiàn)生防菌和化學(xué)農(nóng)藥綜合利用的前提是生防菌對化學(xué)農(nóng)藥要有一定的耐藥性。本試驗篩選出突變株ΜV-2、ΜV-4對福美雙具有高抗性且對病原菌的抑制作用有所提高；福美雙和鏈霉菌協(xié)同使用對紫絲核菌的抑菌作用與單獨使用鏈霉菌和福美雙藥液有明顯提高。有效降低了放線菌對化學(xué)藥劑的敏感性、增大了放線菌的生防潛能，使生防放線菌與殺菌劑協(xié)同效應(yīng)在綜合防治體系中的應(yīng)用成為可能。

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Mutation Breeding of Thiram-Resistant MutantsStreptomycessampsonii/

Yu Qin, Zhu Tianhui, Li Shujiang, An Xiaolong(Sichuan Agricultural University, Ya’an 625000, P. R. China)//

余琴，女，1988年9月生，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。

朱天輝，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail：zhuth1227@tom.com。

2013年10月27日。

S718.8

1) 四川省教育廳重點項目(003z1100)。

責(zé)任編輯：程 紅。