謝濱姣 李海濤 劉榮梅 林慧巖 杜傳英 高繼國

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150030)

一株對害蟲具有高毒力的蘇云金芽胞桿菌1)

謝濱姣 李海濤 劉榮梅 林慧巖 杜傳英 高繼國

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150030)

對來自黑龍江省哈爾濱市橫頭山國家森林公園的200個土壤樣品進(jìn)行了蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)的分離，獲得12株菌株。經(jīng)生物學(xué)多樣性分析選取3株菌株進(jìn)行晶體形態(tài)分析、殺蟲晶體蛋白SDS-PAGE分析，并測定其室內(nèi)殺蟲活性。室內(nèi)殺蟲生物活性測定結(jié)果表明，菌株HTS-S-38對甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)的LC50分別為0.536、0.296 μg/g。經(jīng)鑒定，菌株HTS-S-38含有cry1Aa、cry1Ac、cry1Ia、cry2Ab、vip3Aa殺蟲基因及AiiA、chiB。菌株HTS-S-38對鱗翅目昆蟲的高毒力表明其可作為生物農(nóng)藥工程菌的菌株基礎(chǔ)。

蘇云金芽胞桿菌；甜菜夜蛾；亞洲玉米螟；殺蟲基因

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-143～147，153

We isolated 12Bacillusthuringiensisstrains from 200 soil samples from Hengtou Mountain, nearby Harbin, in Heilongjiang Province. Three strains were selected on the spore-crystal microscopy, insecticidal crystal protein electrophoresis and insecticidal activity after the biological diversity analysis. There were globular crystal, large and small bipyramidal crystal, cubic crystal types in three Bt strains. Strain HTS-S-38 showed highly toxic againstSpodopteraexiguaandOstriniafurnacaliswith 0.536 μg/g and 0.296 μg/g of LC50, respectively. Strain HTS-S-38 containedcry1Aa,cry1Ac,cry1Ia,cry2Aa,cry2Ab,vip3Aagenes,AiiA, andchiBgenes. Strain HTS-S-38 had highly toxic against Lepidoptera, which provided a basic strain for biological pesticide Bt engineering bacteria.

KeywordsBacillusthuringiensis;Spodopteraexigua;Ostriniafurnacalis; Insecticidal gene

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，在《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》中被歸屬為第二類第十八群、芽胞桿菌屬的一個種[1]。已有數(shù)據(jù)表明Bt可對16個目3 000多種害蟲有效[2]。自1938年產(chǎn)業(yè)化以來，Bt成功發(fā)展為目前全球應(yīng)用最廣的微生物殺蟲劑，在害蟲的防治中起到了越來越重要的作用[3-5]，尤其是它對哺乳類動物的低毒力促進(jìn)了對新型菌株及殺蟲基因的篩選[6]。但隨著Bt生物農(nóng)藥及抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因作物的產(chǎn)業(yè)化，其高效的殺蟲毒力和高度的特異性對其靶標(biāo)害蟲造成了強(qiáng)大的選擇壓力，害蟲對Bt殺蟲劑抗性問題不斷在實驗室和田間試驗中得到證實[7]。因此，篩選新型的具有高毒力、廣譜的殺蟲菌株，克隆新的殺蟲基因成為延緩昆蟲抗性的重要研究方向。目前，Bt的殺蟲蛋白主要有Cry蛋白[8]，Cyt蛋白[8]，Vip蛋白[9-12]和Sip蛋白[13]。PCR-RFLP技術(shù)已經(jīng)成為鑒定殺蟲蛋白基因型最廣泛的研究方法[14]，不僅能檢測出已知基因，還能檢測出一些未知基因。除此之外，Bt還產(chǎn)生一些其他的活性物質(zhì)，如，胞內(nèi)解酯酶AiiA蛋白[15-16]、幾丁質(zhì)酶[17]等。橫頭山國家森林公園是黑龍江省哈爾濱市周邊生態(tài)環(huán)境比較原始的地區(qū)，于2007年9月試營業(yè)開放，2008年1月由國家林業(yè)局批準(zhǔn)晉升為國家級公園，同年12月被列為省級地質(zhì)公園，很可能蘊(yùn)藏著新的Bt資源及新型殺蟲蛋白基因，因此對橫頭山的Bt資源的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

液體LB：酵母粉0.5%，胰蛋白胨1%，NaCl 1%，pH=7.0，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。固體LB：在液體培養(yǎng)基中加入1.3%瓊脂，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。液體牛肉膏蛋白胨：牛肉膏0.3%，大豆蛋白胨0.5%，pH=7.2，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。限制性內(nèi)切酶及連接酶購自TaKaRa公司，Taq混合酶購自康為公司，KOD高保真酶購自東洋坊公司。分析純化學(xué)試劑均為市售。甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)和大猿葉甲(Colaphellusbowringi)為中國農(nóng)科院植物保護(hù)研究所提供的標(biāo)準(zhǔn)化試蟲。

1.2 方法

土樣采集及菌株分離：土壤樣品采集自黑龍江省哈爾濱市橫頭山國家森林公園。取表層下5～10 cm土壤，共采集200份土壤樣品。采用溫度法進(jìn)行菌株的篩選[18]。

Bt基因組的提?。悍蛛x純化后的Bt菌在固體LB培養(yǎng)基上30 ℃過夜培養(yǎng)12 h，采用張彥蕊等[19]的方法提取基因組。

Bt菌株的多樣性分析：以本研究所篩的菌株基因組為模板，利用兼并引物對Fcon_1f/Fcon_5r[20]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)一步用Hinf I對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切消化，對消化產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，分析菌種的多樣性。

Bt掃描電鏡樣品的制備：將Bt菌株在1/2 LB平板上劃線培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)36 h，約50%產(chǎn)生晶體。收集菌體用滅菌水洗3次，12 000 r/min，離心10 min，收集芽胞和晶體的混合物。將沉淀懸浮在1 mL滅菌水中，混勻后取少量菌液均勻涂于1 cm2薄玻璃片上，晾干備用。電鏡觀察離子濺射噴金2 nm掃描。

庹明珠認(rèn)為，“有人才有事”，要做好企業(yè)，首要解決的問題就是人的問題，他認(rèn)為晟圖機(jī)械的使命之一，就是讓晟圖機(jī)械的員工在企業(yè)這座大學(xué)里，技能不斷發(fā)展，生活過得更好，而這個使命的達(dá)成就落地于企業(yè)活動、員工福利等諸多瑣碎的“小確幸”之中。

Bt菌株晶體蛋白SDS-PAGE分析：取0.1 g胞晶混合物，1 mol/L NaCl洗，滅菌水反復(fù)洗3次，取處理后的樣品100 μL，加入25 μL的NaOH，室溫反應(yīng)5 min，加入5倍Loading Buffer，混勻，ddH2O補(bǔ)齊體系至200 μL，100 ℃煮5 min，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液加樣，進(jìn)行SDS-PAGE分析。以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)計算菌體的胞晶含量。采用National Institutes of Health開發(fā)的Image J分析SDS-PAGE圖譜來對蛋白進(jìn)行定量。

室內(nèi)殺蟲活性測定樣品的制備：挑取單菌落于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)12 h后，轉(zhuǎn)接于200 mL液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中(1%接菌量)，30 ℃，220 r/min，培養(yǎng)至裂解產(chǎn)生晶體(70%以上)，離心收集胞晶混合物，用含有1 mol/L NaCl和2% TritionX 100的溶液懸浮洗滌沉淀2次，然后用ddH2O懸浮洗滌沉淀2次，最后溶于ddH2O或10 mmol/L Tris-HCl，用SDS-PAGE進(jìn)行定量分析，-20 ℃保存。

甜菜夜蛾生物活性測定：①稱取30 g人工飼料置滅菌培養(yǎng)皿中，加入3 mL待測樣品溶液，用藥匙充分?jǐn)嚢杈鶆?，室溫放置，使飼料多余水分蒸發(fā)。②將全部飼料分裝于3個已消毒的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。③先將幼蟲輕輕抖落在一張白紙上，再將白紙倒置，此時幼蟲將從白紙上開始拉絲下滑，用毛筆輕輕挑絲將幼蟲接于24孔板中，每孔1頭；接完后，在24孔板上蓋一層吹塑紙，再蓋蓋子，并用橡皮筋固定，嚴(yán)格密封，防止幼蟲逃逸。④放置于光照培養(yǎng)箱中，25 ℃培養(yǎng)，光周期為12 h光照、12 h黑暗。從第2天起，濕度<30%時，需要額外添加水盆增加濕度。每天觀察，檢查光照、濕度、溫度以及飼料是否霉變，是否有水蒸氣凝結(jié)。⑤7 d后，分別調(diào)查死、活蟲數(shù)，計算校正死亡率和LC50。

亞洲玉米螟生物活性測定：①稱取15 g人工飼料放置于無菌的培養(yǎng)皿中。②加入待測樣品溶液1.5 mL，充分?jǐn)嚢杌靹蚱骄盅b于3個培養(yǎng)皿中。③根據(jù)飼料的干濕程度室溫放置一段時間，直到飼料表面沒有水滴，每皿接入30頭初孵幼蟲，用醫(yī)用膠帶封口，每個濃度重復(fù)3次，共處理90頭試蟲。④將樣品置于光照培養(yǎng)箱，25 ℃培養(yǎng)，光周期為14 h光照、10 h黑暗，每天觀察飼料干濕程度，適當(dāng)做出微調(diào)。⑤培養(yǎng)7 d后，調(diào)查死蟲和活蟲數(shù)，計算死亡率、校正死亡率和LC50。

大猿葉甲生物活性測定：①配置和量取10～20 mL待測樣品溶液加入滅菌培養(yǎng)皿中，加入0.1%家用洗滌劑。②選取新鮮的油菜或小白菜葉片(大小一致)，均勻地浸入待測樣品溶液中，10 s。③取出后于吸水紙上室溫下晾干(中間翻轉(zhuǎn)1次)分裝于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中墊入無菌水噴濕的濾紙(需用錫箔紙包裝滅菌)。④用毛筆輕輕接入初孵幼蟲，每培養(yǎng)皿接30頭蟲，每處理重復(fù)3次。⑤放置光照培養(yǎng)箱中，25 ℃培養(yǎng)，光周期為14 h光照、10 h黑暗。每天觀察，檢查葉片是否腐爛或干枯，是否有水蒸氣凝結(jié)。⑥48 h后，調(diào)查死、活蟲數(shù)，計算校正死亡率和LC50。

數(shù)據(jù)分析：將各蟲種試驗數(shù)據(jù)分別計算活蟲數(shù)及對應(yīng)死蟲數(shù)，采用POLO軟件計算LC50，所有統(tǒng)計分析在SPSS 16.0軟件中進(jìn)行。

Bt菌株殺蟲基因的鑒定：采用PCR-RFLP方法，對HTS-S-38菌株進(jìn)行殺蟲基因的鑒定，使用的引物序列見表1(表中省略了沒有獲得陽性克隆的引物)，cry1A類基因用PvuII進(jìn)行酶切鑒定[21]，cry1I類基因用Hinf I進(jìn)行酶切鑒定[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt菌株的分離

從采集的200份土壤樣品中分離到12株Bt菌株，出菌率為6%。12株菌株的晶體有長雙錐體形、短雙錐體形、立方體形、球形等多種晶體形態(tài)(表2)。

2.2 Bt菌株的多樣性

對所篩的12株菌株進(jìn)行了生物多樣性分析，結(jié)果見圖1。選定其中鑒定結(jié)果顯示不同的菌株HTS-S-12、HTS-S-38、HTS-S-69進(jìn)行了掃描電鏡晶體形態(tài)觀察(圖2)、晶體蛋白SDS-PAGE分析，以及室內(nèi)殺蟲活性測定。

表1 用于PCR擴(kuò)增的引物序列

表2 分離菌株晶體形態(tài)

M．DL2000；1．HTS-S-3；2.HTS-S-7；3.HTS-S-9；4.HTS-S-12；5.HTS-S-38；6.HTS-S-47；7.HTS-S-69;8.HTS-S-81；9.HTS-S-96；10.HTS-S-124；11.HTS-S-149；12.HTS-S-173。

圖1 Bt分離菌株的生物多樣性

2.3 Bt菌株晶體蛋白SDS-PAGE

通過SDS-PAGE分析菌株HTS-S-12、HTS-S-38、HTS-S-69所表達(dá)的ICPs分子質(zhì)量。由圖3可見，HTS-S-12表達(dá)130 ku蛋白；HTS-S-38表達(dá)130、60 ku蛋白；HTS-S-69表達(dá)130、60 ku蛋白。

①為HTS-S-12；②為HTS-S-38；③為HTS-S-69；B.雙錐體形；C.方形；G.球形；Sp.芽胞。

圖2 Bt菌株的油鏡、掃描電鏡結(jié)果

M.Marker；1.HTS-S-12；2.HTS-S-38；3.HTS-S-69。

2.4 Bt菌株晶體蛋白活性

利用10 mmol/L Tris-HCl溶液作為陰性對照，對菌株HTS-S-12、HTS-S-38、HTS-S-69進(jìn)行甜菜夜蛾、亞洲玉米螟、大猿葉甲的殺蟲活性初篩，測定結(jié)果見表3。初篩結(jié)果顯示菌株HTS-S-38、HTS-S-69對甜菜夜蛾、玉米螟有高毒力。用這2種供試?yán)ハx對菌株HTS-S-38進(jìn)行毒力復(fù)篩，利用10 mmol/L Tris-HCl溶液作為陰性對照，設(shè)定0.187 5、0.375 0、0.750 0、1.500 0、3.000 0、6.000 0、12.000 0、24.000 0 μg/g 7個濃度測定其生物學(xué)活性。測定結(jié)果表明，菌株HTS-S-38對甜菜夜蛾的LC50為0.536 μg/g，對玉米螟的LC50為0.296 μg/g，且2種存活試蟲都表現(xiàn)出明顯體質(zhì)量抑制。

表3 Bt菌株對供試?yán)ハx毒力初篩的校正致死率 %

注：甜菜夜蛾、亞洲玉米螟、大猿葉甲的對照死亡率分別為8.33%、7.78%、3.33%。

2.5 HTS-S-38殺蟲晶體蛋白基因型的PCR鑒定

對HTS-S-38殺蟲晶體蛋白的基因型進(jìn)行了PCR-RFLP鑒定，結(jié)果顯示，該菌株中含有cry1Aa、cry1Ac、cry1Ia、cry2Ab、vip3Aa；除此之外，還含有AiiA基因和chiB基因。HTS-S-38所含的殺蟲基因的PCR鑒定結(jié)果以及cry1A、cry1I類的PCR-RFLP鑒定結(jié)果見圖4和圖5。用PvuII酶切cry1A的PCR產(chǎn)物，顯示cry1A的PCR產(chǎn)物中有cry1Aa和cry1Ac。用Hinf I酶切cry1I的PCR產(chǎn)物，顯示cry1I的PCR產(chǎn)物中只含有cry1Ia。

M.DM2000 plus；1.cry1A；2.cry1I；3.cry2A；4.vip3Aa；5.AiiA；6.chiB。

圖4 Bt菌株HTS-S-38殺蟲基因PCR鑒定

3 結(jié)論與討論

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)課題組長期開展對東北地區(qū)新的Bt菌株資源的發(fā)掘工作，由橫頭山地區(qū)采集的200個土壤樣品中分離出12株蘇云金芽胞桿菌，出菌率為6%。其中編號為HTS-S-38的菌株對甜菜夜蛾、亞洲玉米螟表現(xiàn)出了較高的活性，其LC50分別是0.536、0.296 μg/g，其產(chǎn)生高殺蟲活性的原因尚不是明確，還需要進(jìn)一步的試驗分析、驗證。這12株菌顯示出較低的菌株多樣性，可能由于土樣采集的密集程度、植被覆蓋種類相似等原因，導(dǎo)致菌株的多樣性與樣品采集密度關(guān)系不具有代表性，在以后的研究中可采用預(yù)先設(shè)置樣方統(tǒng)計、適當(dāng)?shù)脑龆嗖蓸恿?、擴(kuò)大采樣地范圍、多次采集并采取不同的采集密度等方法繼而總結(jié)出采樣量與菌種多樣性之間的代表關(guān)系，這對更有效的篩選新型Bt殺蟲菌株具有重要的意義。

M.DM2000 plus；1.cry1APCR產(chǎn)物;2.cry1A經(jīng)PvuII酶切產(chǎn)生的片段；3.cry1IPCR產(chǎn)物;4.cry1A經(jīng)Hinf I酶切產(chǎn)生的片段。

圖5 Bt菌株HTS-S-38cry1A和cry1I類殺蟲基因的PCR-RFLP鑒定圖譜

本研究篩選出的菌株HTS-S-38對甜菜夜蛾、亞洲玉米螟均具有較高的毒力，HTS-S-38至少含有cry1Aa、cry1Ac、cry1Ia、cry2Ab、vip3Aa5種殺蟲基因，以及AiiA基因和chiB基因。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Cry1C蛋白和Cry1D蛋白對甜菜夜蛾有較高活性，也有學(xué)者報道Cry1Ab[23]、Vip[24]對甜菜夜蛾有較高活性。目前國外對甜菜夜蛾有較好殺蟲活性的商業(yè)化殺蟲劑有Agree和Xentari等，其主要是B.thuringiensissubsp.kustaki亞種HD-1等菌株所產(chǎn)生的Cry1類和Cry2類蛋白[25]。郭靖等[26]篩選出的Bt菌株P(guān)S3-C2對甜菜夜蛾的LC50為1.87 μg/g；武漢KN11對甜菜夜蛾的LC50為2.23 μg/g。其中PS3-C2不含有cry1A類基因，它含有cry1C、cry2A、cry9及vip3A基因。菌株HTS-S-38的PCR-RFLP及SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示該生測樣品的胞晶混合物中含有Cry1Aa、Cry1Ac、Cry2Ab，并不含有Cry1C、Cry1D及Vip3Aa，由此筆者推測HTS-S-38對甜菜夜蛾的高殺蟲活性主要來自于Cry1Aa、Cry1Ac、Cry2Ab蛋白的協(xié)同增效。Liu等[27]指出Vip3Aa11和Vip3Aa19都對亞洲玉米螟具有低活性。李長友等[28]用大腸桿菌克隆的Cry2Ab4蛋白對甜菜夜蛾和亞洲玉米螟沒有表現(xiàn)出殺蟲活性。而Xue等[29]對亞洲玉米螟的測試結(jié)果顯示Cry1Ah、Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1Ie的LC50分別為0.05、0.41、0.23、3.50 μg/g。菌株HTS-S-38生測樣品中含有Cry1Ac蛋白，但它顯示的毒力卻比大腸桿菌表達(dá)的Cry1Ac的活性高，由此推測菌株HTS-S-38中可能有其他殺蟲蛋白對其對亞洲玉米螟的活性起了增效作用。

本研究采用NaOH溶解方法對殺蟲晶體蛋白進(jìn)行定量，從而推算出晶體蛋白的LC50，但由于胞晶混合物生測樣品中不可能完全清除芽胞，由此推測昆蟲食入芽胞后，可能發(fā)生芽胞效應(yīng)。昆蟲的主腸道給蘇云金芽胞桿菌提供了復(fù)蘇發(fā)育的媒質(zhì)，新萌發(fā)的營養(yǎng)體分泌了其他的殺蟲蛋白如Vip蛋白、幾丁質(zhì)酶協(xié)同增效了HTS-S-38菌株的殺蟲作用。Bt的芽胞可以大大提高殺蟲蛋白的毒力，幫助殺死昆蟲。研究發(fā)現(xiàn)在純的晶體蛋白中加入芽胞對小菜蛾的毒力提高了10倍[30]，對甜菜夜蛾的毒力提高了10倍[31]，對印度谷螟的毒力提高了35倍[32]，對蠟螟的毒力提高了1 000倍[33]。芽胞效應(yīng)的形成一部分原因是因為芽胞衣上的類似晶體蛋白物質(zhì)具有輔助殺蟲作用[34-36]，而另一部分原因和Vip3A的存在有關(guān)。Donovan等[37]為了確定Vip3A對昆蟲的毒性，將vip3A基因從Bt HD1菌株中刪除，得到菌株HD1ΔVip3A，生測結(jié)果顯示對小地老虎的毒性后者為前者的1/4，對甜菜夜蛾的毒性后者不足前者的1/10。HD1芽孢的加入使純化的Cry1蛋白對甜菜夜蛾的活性增加了約600倍，表明Vip3A蛋白是殺蟲活性的重要組成部分。同時發(fā)現(xiàn)除去了vip3Aa基因的芽胞加入到Cry蛋白中，毒力提高不明顯。幾丁質(zhì)酶可以使Bt對甜菜夜蛾的殺蟲活性提高1.8～2.4倍[38]。Arora等[39]從Bt菌株HD-1中通過離子交換和凝膠層析電泳純化得到36 ku的幾丁質(zhì)酶。這種幾丁質(zhì)酶在生長培養(yǎng)基中含有幾丁質(zhì)時產(chǎn)生，甚至在葡萄糖出現(xiàn)時也會產(chǎn)生，此時表達(dá)的幾丁質(zhì)酶會影響Vip蛋白對斜紋夜蛾幼蟲的殺蟲活性。Hu等[40]將純化的幾丁質(zhì)酶與Cry1Ac毒素進(jìn)行生測的數(shù)據(jù)表明幾丁質(zhì)酶的存在能夠?qū)ry1Ac的毒力提高1倍左右。芽胞效應(yīng)可能是菌株HTS-S-38對甜菜夜蛾、玉米螟具有高毒力的主要原因，其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

雖然HTS-S-38未顯示出廣譜的殺蟲毒力，但作為具有特異高活性的Bt菌株，對于生物農(nóng)藥工程菌的研制及抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的構(gòu)建提供了菌株和基礎(chǔ)基因資源，對延緩害蟲對Bt的抗性具有積極的意義。目前HTS-S-38菌株中的大部分殺蟲基因已經(jīng)被克隆，將會用于進(jìn)行下一步詳細(xì)的殺蟲蛋白的生物學(xué)活性測定以及菌株高毒力原因的分析。

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ABacillusthuringiensisStrain with a Strong Virulence Against Pest/

Xie Binjiao, Li Haitao, Liu Rongmei, Lin Huiyan, Du Chuanying, Gao Jiguo(Northeast Agricultural University, Harbin 150030, P. R. China)//

1) 國家“863”項目(2010RCB54)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃課題(2011AA10A203)；轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2014ZX0800913B-002)；黑龍江省科學(xué)技術(shù)研究項目(12521021)。

謝濱姣，女，1988年8月生，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，碩士研究生。

高繼國，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教授。E-mail：gaojiguo1961@hotmail.com。

2014年3月4日。

S476.11

責(zé)任編輯：程 紅。