付 莉 胡春祥

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

氧化樂果和甲萘威亞致死劑量對黃褐天幕毛蟲2種解毒酶活性的影響1)

付 莉 胡春祥

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

室內(nèi)條件下采用葉片藥膜法分別測定氧化樂果和甲萘威對黃褐天幕毛蟲(Malacosomaneustriatestacea)3齡幼蟲的毒力；采用分光光度法測定2種藥劑亞致死劑量對黃褐天幕毛蟲的羧酸酯酶(CarE)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的影響。結(jié)果表明：氧化樂果對黃褐天幕毛蟲的24、48 h的LC20分別為33.975、8.298 mg·L-1，甲萘威24、48 h的LC20分別為23.314、1.863 mg·L-1。經(jīng)氧化樂果和甲萘威亞致死劑量處理后，幼蟲體內(nèi)的CarE在6～48 h內(nèi)均被不同程度抑制，其中處理12 h活性降到最低，分別為對照的0.51、0.36倍；氧化樂果亞致死劑量對幼蟲體內(nèi)的GSTs表現(xiàn)為抑制-激活-抑制作用，在處理后24 h對該酶的激活作用最強，為同期對照的1.37倍。亞致死劑量甲萘威處理6～12 h內(nèi)幼蟲體內(nèi)GSTs被激活，隨后逐漸被抑制。

黃褐天幕毛蟲；亞致死劑量；羧酸酯酶；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-126～128，132

We adopted leaf-dip method to evaluate omethoate and carbaryl against the third instar ofMalacosomaneustriatestaceaand used sepectrophotometry to assess the effect of sublethal concentration of the two pesticides on activities of carboxylesterase and glutathione S-transferase. For 24 h and 48 h treatment, the LC20of omethoate were 33.975 and 8.298 mg·L-1, and the LC20of carbaryl were 23.314 and 1.863 mg·L-1, respectively. The activities of CarE in lavae were inhibited at different level within 6-48 h treatment of sublethal concentration of omethoate and carbary. Compared to CK, the activities of CarE were decreased by 51% and 36%, respectively, after 12 h treatment, which were decreased to the lowest level. By the treatment of the sublethal concentration of omethoat, the activity of GSTs was inhibited firstly, then increased and inhibited finally. After 24 h treatment with sublethal concentration of omethoate, the activity was increased by 1.37 times compared to that of CK, which was at highest level. Within 6-12 h of treatment with sublethal concentration of carbaryl, the activity of GSTs in larvae was increased firstly, and then decreased gradually.

KeywordsMalacosomaneustriatestacea; Sublethal doses; Carboxylesterase; Glutathione S-transferase

黃褐天幕毛蟲(Malacosomaneustriatestacea)屬鱗翅目枯葉蛾科，其分布范圍廣，食性雜，危害重，主要以幼蟲危害柞樹、柳樹、楊樹、樺樹等闊葉樹[1-2]，嚴重發(fā)生時，可將被害樹木葉片全部吃光，造成林木上部枯死，給林木生長造成嚴重危害[3]。長期不合理的使用殺蟲劑，會使害蟲的抗藥性逐漸增強，而殺蟲劑的亞致死效應(yīng)能夠?qū)е吕ハx生理、行為的改變，生殖力的變化，發(fā)育歷期的變化以及昆蟲體內(nèi)重要的靶標酶和解毒酶系的變化等[4-5]。研究殺蟲劑對昆蟲的亞致死效應(yīng)，有助于正確評價化學(xué)農(nóng)藥的防治效果，協(xié)調(diào)化學(xué)防治與生物防治[6]。本研究主要測定了黃褐天幕毛蟲經(jīng)亞致死濃度(LC20)的氧化樂果、甲萘威處理后幼蟲體內(nèi)羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的變化，以期為氧化樂果、甲萘威的合理使用和黃褐天幕毛蟲的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

95.8%甲萘威原藥(南開大學(xué)國家農(nóng)藥工程中心)；82.8%氧化樂果原油(鄭州沙隆達偉新農(nóng)藥有限公司)；固藍B鹽、十二烷基硫酸鈉(SDS)、毒扁豆堿、1-氯-2，4二硝基苯(CDNB)、考馬斯亮藍G-250、還原型谷胱甘肽(GSH)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫代蘇糖醇(DTT)均購自Sigma公司，Triton X-100購自AMRESCO公司，α-乙酸萘酯(α-NA)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、丙酮、牛血清白蛋白均購自天津永大化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)、D-37520冷凍離心機(德國Sorvall,biofuge stratos)、TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、電子天平(美國奧豪斯Explorer Pro)。

1.2 供試蟲源

黃褐天幕毛蟲于2013年5月采自東北林業(yè)大學(xué)實驗林場，幼蟲用健康無藥劑的新鮮楊樹葉片飼養(yǎng)，每天換葉并及時清理幼蟲的排泄物及食物殘渣，選取健康、大小一致的3齡幼蟲用于毒力和酶活性測定。

1.3 毒力測定

采用葉片藥膜法，先將原藥用丙酮配成5×104mg·L-1的母液，再用蒸餾水(含0.1% Triton X-100)將母液稀釋為800、400、200、100、50、10 mg·L-1，以蒸餾水(含0.1% Triton X-100)處理作對照，將新鮮無農(nóng)藥污染的楊樹葉片浸于稀釋好的農(nóng)藥中10 s，在陰涼處晾干，用蘸有充足水分的脫脂棉裹住葉柄，放于透氣性良好的透明養(yǎng)蟲瓶(直徑9 cm、高14 cm)中，接入健壯且饑餓12 h的黃褐天幕毛蟲3齡幼蟲，每瓶放10頭，每個濃度重復(fù)3次，置于恒溫養(yǎng)蟲室(溫度(25±1)℃，相對濕度60%～80%，光周期16 h光照8 h黑暗)飼養(yǎng)。分別于6、12、24、36、48 h后檢查死亡數(shù)，用毛筆輕觸幼蟲，非功能性顫抖者視為死亡。

1.4 試蟲處理

根據(jù)毒力測定結(jié)果，以24 h的LC20值作為亞致死劑量，處理健康、大小一致且饑餓12 h的黃褐天幕毛蟲3齡幼蟲，以清水處理為對照，處理方法和飼養(yǎng)條件同1.3。分別于處理6、12、24、48 h后取健壯、活潑的幼蟲，冰箱中-80 ℃保存，用于酶活性的測定。

1.5 酶活性測定

羧酸酯酶活性：隨機挑取3頭3齡天幕毛蟲放入3 mL 0.04 mol·L-1預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH=7.0)中，冰浴，勻漿，于4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清液為待測酶液?；钚詼y定參考Van Asperen[7]的方法，在試管中加入0.04 mol·L-1磷酸緩沖液(pH=7.0)0.45 mL，1.8 mL 3×10-4mol·L-1α-乙酸萘酯(含毒扁豆堿1∶1)，0.05 mL待測酶液，搖勻后在30 ℃水浴中精確計時15 min，加入0.9 mL顯色劑(V(1%固藍B鹽)∶V(5%十二烷基硫酸鈉)=2∶5)終止反應(yīng)，在600 nm波長下測定OD值，每個處理重復(fù)3次。根據(jù)α-萘酚標準曲線計算出羧酸酯酶催化生成的α-萘酚量，再根據(jù)蛋白質(zhì)含量，計算出羧酸酯酶的比活力。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性：隨機挑取3頭3齡黃褐天幕毛蟲放入3 mL 0.1 mol·L-1、pH=6.5預(yù)冷的磷酸緩沖液(含1 mmol·L-1EDTA-Na2，0.1 mmol·L-1PMSF，0.1 mmol·L-1DTT)，勻漿，于4 ℃，10 000 r/min離心30 min，取上清液為待測酶液。活性測定參照Habig等[8]的方法，在試管中加入2.3 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液，0.5 mL還原型谷胱甘肽和0.1 mL酶液，最后加入0.1 mL 1.0 mmol·L-1CDNB顯色液并混勻，在空白對照杯中用磷酸緩沖液代替正常酶液，于340 nm波長處，用時間驅(qū)動程序在雙光束紫外可見分光光度計上記錄3 min內(nèi)(每隔30 s讀一次)動力學(xué)曲線，記錄反應(yīng)速度。GSTs活性以每毫克蛋白質(zhì)每分鐘分解底物的微摩爾數(shù)表示。

蛋白質(zhì)含量測定參照Bradford[9]的考馬斯亮藍G-250法。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用POLO軟件處理分析毒力測定結(jié)果，計算亞致死濃度(LC20)及95%置信區(qū)間；使用SPSS 17.0進行方差分析，采用LSD法進行差異顯著性檢驗，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化樂果和甲萘威對黃褐天幕毛蟲的毒力

表1顯示了氧化樂果和甲萘威對黃褐天幕毛蟲3齡幼蟲的亞致死濃度(LC20)和致死中濃度(LC50)及其95%置信區(qū)間。隨著處理時間增長，LC20和LC50逐漸減小，殺蟲劑毒力越來越大。氧化樂果和甲萘威對黃褐天幕毛蟲24 h的致死中濃度LC50分別為84.555、93.052 mg·L-1；24 h亞致死劑量LC20分別為33.975、23.314 mg·L-1。

表1 氧化樂果和甲萘威對黃褐天幕毛蟲的毒力

2.2 亞致死劑量殺蟲劑對黃褐天幕毛蟲幼蟲CarE活性的影響

氧化樂果亞致死劑量處理后，黃褐天幕毛蟲體內(nèi)CarE活性隨處理時間的延長表現(xiàn)為先降后升再降的趨勢。處理6 h后，體內(nèi)的CarE活性略有增強，但與對照組差異不顯著(P>0.05)，其余各時間點，處理組的CarE活性均低于對照，且差異極顯著(P<0.01)，氧化樂果對該酶活性主要表現(xiàn)為抑制作用。其中，處理12 h后，對該酶的抑制作用最強，活性為對照組的0.51倍。黃褐天幕毛蟲受甲萘威脅迫后，CarE活性在各個時間點，處理組CarE活性均低于對照組，差異極顯著(P<0.01)，其中，12 h抑制率最大，活性為對照的0.36倍(表2)?？梢?，亞致死劑量的氧化樂果和甲萘威均對黃褐天幕毛蟲體內(nèi)的CarE具有明顯的抑制作用。

表2 亞致死劑量殺蟲劑對黃褐天幕毛蟲幼蟲解毒酶活性的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，比值=處理組酶比活力/相應(yīng)對照組酶比活力，** 表示處理組與對照組之間差異顯著(P<0.01)。

2.3 亞致死劑量殺蟲劑對黃褐天幕毛蟲幼蟲GSTs活性的影響

氧化樂果和甲萘威處理后，黃褐天幕毛蟲幼蟲體內(nèi)的GSTs活性處于動態(tài)變化中(表2)。48 h處理時間內(nèi)，亞致死劑量的氧化樂果對該酶活性呈先抑制再激活再抑制的趨勢，處理6 h后，處理組黃褐天幕毛蟲體內(nèi)GSTs為同期對照組的0.82倍，且與對照組差異極顯著(P<0.01)。處理12和24 h，分別為對照組的1.20和1.37倍，表現(xiàn)為顯著的激活作用(P<0.01)，隨后在48 h GSTs活性被抑制。亞致死劑量的甲萘威對黃褐天幕毛蟲體內(nèi)的GSTs在6和12 h表現(xiàn)為激活作用，其中處理組12 h的酶活性為同期對照組的1.31倍，與對照組差異極顯著(P<0.01)；而在24～48 h，對該酶活性表現(xiàn)為抑制作用，48 h酶活性為6 h酶活性的58.64%，是同期對照組的0.76倍，與對照組差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶，能夠代謝有毒外源化合物，使昆蟲自身減少或免除毒害作用[10]。羧酸酯酶具有廣泛的底物專一性及重疊性，能催化水解脂肪族羧酸酯、芳酸酯和相應(yīng)的硫代酯等多種化合物，害蟲通過產(chǎn)生大量該酶與殺蟲劑結(jié)合，使殺蟲劑在到達靶標位點之前被阻斷或降解[11]。張元建等[12]研究了甜菜夜蛾(Spodopteraexigua(Hübner))經(jīng)亞致死劑量的辛硫磷LC20處理后，酶活性在24 h時與對照相比降低了77.58%，經(jīng)溴氰菊酯亞致死劑量LC20處理后，酶活性在48 h內(nèi)持續(xù)下降。廖月枝等[13]研究發(fā)現(xiàn)甲氧蟲酰肼對舞毒蛾(LymantriadisparL.)4齡幼蟲的羧酸酯酶有明顯抑制作用，在各個處理時間點，對該酶的抑制作用與對照組差異極顯著。本研究表明，不同藥劑對黃褐天幕毛蟲羧酸酯酶抑制作用不同，亞致死劑量的氧化樂果對黃褐天幕毛蟲羧酸酯酶活力在12 h之后開始表現(xiàn)出明顯的抑制作用，而亞致死劑量的甲萘威的抑制作用在6 h之后就開始明顯，且兩種藥劑處理后的48 h內(nèi)，處理組的羧酸酯酶的活性均明顯低于對照組，關(guān)于這兩種藥劑對羧酸酯酶的具體影響機制需要進一步研究。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是催化還原型谷胱甘肽與各種親電子化合物進行親和加成反應(yīng)的一種酶，參與很多分子的解毒機制，并轉(zhuǎn)運一些重要的親脂性化合物，在昆蟲遭遇逆境時，發(fā)揮脫毒和抗氧化功能，是昆蟲對有機磷類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的重要因素[14-16]。陳鳳菊等[17]用含0.005%單寧酸的飼料飼養(yǎng)5齡和6齡棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera(Hübner))幼蟲后，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性明顯降低，分別為對照的59%和67%。魏波等[18]研究了辛硫磷亞致死劑量處理棉鈴蟲3齡幼蟲24 h后，活性達到高峰，比活力比對照組增加了53%。本研究表明，氧化樂果和甲萘威對黃褐天幕毛蟲體內(nèi)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活性影響不僅與殺蟲劑種類有關(guān)，而且具有一定的時間效應(yīng)。亞致死劑量的氧化樂果對黃褐天幕毛蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在6 h時與同時期的對照相比表現(xiàn)為抑制作用，12～24 h表現(xiàn)為激活作用，隨后在48 h酶活性又被抑制。而亞致死劑量的甲萘威處理黃褐天幕毛蟲后，體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性在6～12 h被激活，在48 h時活性被顯著抑制，而有關(guān)兩種殺蟲劑對羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶作用的生物化學(xué)和分子生物學(xué)機制有待進一步研究。

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Effect of Sublethal Concentration of Omethoate and Carbaryl on the Activities of Two Detoxifying Enzymes inMalacosomaneustriatestacea/

Fu Li, Hu Chunxiang(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//

1) 國家林業(yè)局公益項目(201104069)。

付莉，女，1987年12月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。

胡春祥，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail：hcx386@163.com。

2013年9月11日。

S763.3

責(zé)任編輯：程 紅。