楊 娜，董邁青，謝海東，邢 謙

(青海省地質(zhì)礦產(chǎn)測(cè)試應(yīng)用中心，青海 西寧 810008)

氮是土壤多目標(biāo)地球化學(xué)調(diào)查中規(guī)定定量分析的54種指標(biāo)中的必測(cè)元素。多目標(biāo)地球化學(xué)調(diào)查樣品分析的顯著特點(diǎn)是樣品數(shù)量多，而傳統(tǒng)的測(cè)定地質(zhì)樣品中全氮的含量是采用經(jīng)典的凱氏定氮法[1-2]，凱氏定氮法是測(cè)定化合物或混合物中總氮量的一種方法。目前，普遍采用凱氏定氮法對(duì)土壤、食品、農(nóng)產(chǎn)品、飼料以及一些物質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

運(yùn)用經(jīng)典的凱氏定氮法測(cè)定樣品中氮含量時(shí)，需要通過(guò)觀察來(lái)確定消解是否完全，沒(méi)有確定的消解溫度和時(shí)間，需要分析人員觀察反應(yīng)現(xiàn)象來(lái)判斷，耗費(fèi)人力、時(shí)間，對(duì)于大批量樣品的測(cè)定存在一定的困難。因此有必要對(duì)凱氏定氮法的消解條件進(jìn)行優(yōu)化，包括確定最佳消解溫度和時(shí)間，便于批量消解，提高分析效率。本文通過(guò)選擇料液比、溫度和時(shí)間作為優(yōu)化因素，采用響應(yīng)曲面法(Response Surface Method，RSM)研究各因素的不同水平對(duì)氮的含量的影響。響應(yīng)曲面法不同于正交設(shè)計(jì)的線(xiàn)性模型，是一種多元分析方法，采用該方法可以建立連續(xù)變量曲面模型，是一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最優(yōu)化方法[3]。所謂響應(yīng)曲面法即是將系統(tǒng)的響應(yīng)作為一個(gè)或多個(gè)因子的函數(shù)，運(yùn)用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來(lái)，根據(jù)直覺(jué)的觀察來(lái)選擇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)條件，在工藝優(yōu)化、產(chǎn)品性質(zhì)研究等方面已有廣泛的應(yīng)用[4-9]，可為試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。本文將響應(yīng)曲面分析的方法應(yīng)用于優(yōu)化凱氏定氮法消解條件研究，以利于通過(guò)控制各因素，實(shí)現(xiàn)氮含量的快速準(zhǔn)確測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與主要試劑

多孔溫控電熱板(湖北地質(zhì)試驗(yàn)研究所)，六聯(lián)定氮蒸餾裝置(中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所)。

濃硫酸、氫氧化鈉溶液(400 g/L)、硼酸溶液(200 g/L)、混合加速劑(硫酸鉀+硫酸銅+硒，質(zhì)量比100∶10∶1)、鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.005 mol/L)、甲基紅-溴甲酚綠指示劑等。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為無(wú)氨水。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品

本實(shí)驗(yàn)所用樣品為土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 07423，氮標(biāo)準(zhǔn)值w(N)/10-6的不確定度為1300±100。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

稱(chēng)取0.1～0.5 g土壤樣品于50 mL比色管中，在2 g混合加速劑的共存下，用5 mL濃硫酸煮解氧化，試樣中的氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨，再加入30 mL氫氧化鈉溶液堿化后，加熱蒸餾逸出的氨，經(jīng)硼酸溶液吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定并計(jì)算出試樣中氨的含量[10]。

1.4 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)響應(yīng)曲面法的設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)，共有15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，變量為稱(chēng)樣量與加入硫酸體積之比(料液比，g/mL)、消解溫度和消解時(shí)間，符號(hào)分別表示為x1、x2和x3，響應(yīng)值為氮的含量w(N)/10-6，符號(hào)表示為y，期望獲得土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 07423的w(N)/10-6標(biāo)準(zhǔn)值時(shí)各因素的值。

采用Box-Behnken Design(BBD)建立RSM設(shè)計(jì)，BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是用來(lái)評(píng)價(jià)指標(biāo)和因素之間的非線(xiàn)性關(guān)系的一種實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)組合數(shù)較少，常用于需要對(duì)因素的非線(xiàn)性影響進(jìn)行研究的試驗(yàn)中。試驗(yàn)因素和水平的選值見(jiàn)表1。

表1 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

以w(N)/10-6為響應(yīng)值y，根據(jù)Design-Expert V8軟件，共設(shè)置15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)點(diǎn)為析因點(diǎn)，3個(gè)點(diǎn)為零點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行3次，以估計(jì)誤差。采用BBD建立RSM設(shè)計(jì)，選擇二次多項(xiàng)式逐步回歸方法[11]，BBD設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 BBD設(shè)計(jì)及氮含量的實(shí)驗(yàn)值和計(jì)算值

2.2 模型建立與顯著性檢驗(yàn)

通過(guò)對(duì)料液比、消解溫度、消解時(shí)間三因素進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸，得二次多項(xiàng)式方程：

(1)

響應(yīng)曲面分析中對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合的二次模型方差分析見(jiàn)表3。由表3的方差分析結(jié)果可見(jiàn)，模型的確定系數(shù)R2=0.9758，說(shuō)明該模型極顯著(P<0.0001)，與實(shí)際情況擬合得很好，因此該模型可用來(lái)進(jìn)行響應(yīng)值的預(yù)測(cè)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案正確。各因素的線(xiàn)性效應(yīng)皆顯著，x2x3的交互影響顯著，而x1x2的交互影響不顯著。并且由式(1)計(jì)算獲得的模型計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)測(cè)定值進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1所示，計(jì)算值與實(shí)測(cè)值之間的差異較小。

表3 BBD設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果

圖1 氮含量的實(shí)驗(yàn)值與計(jì)算值的比較

2.3 最佳消解條件的計(jì)算

在料液比取0.3∶5(g/mL)的情況下，由多元回歸方程式所做的消解溫度與消解時(shí)間交互影響氮的含量的響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖2。對(duì)圖2進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，以確定最佳因素水平范圍，通過(guò)計(jì)算可得到最佳因素水平z。

圖2 消解溫度與消解時(shí)間交互影響氮含量的響應(yīng)曲面圖

根據(jù)式(1)，令y=1300，求解得(z1，z2，z3)=(0.104，-0.142，-0.0502)。

換算為：

實(shí)際值(x1，x2，x3)

=(0.104×0.2+0.3，-0.142×35+265，

-0.0502×30+60)

=(0.321，260，58.5)

為了便于實(shí)際操作及計(jì)算簡(jiǎn)便，將最優(yōu)條件修正為料液比為0.3∶5(g/mL)，在260℃下消解60 min，計(jì)算氮含量的理論值為1308×10-6，而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 07423氮含量的標(biāo)準(zhǔn)值為1300×10-6，理論上可以很好地滿(mǎn)足要求。

2.4 最佳消解條件的驗(yàn)證

將土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 07423在確定的優(yōu)化條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得氮含量的平均值為1310×10-6，氮含量的標(biāo)準(zhǔn)值為1300×10-6，測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)值的對(duì)數(shù)誤差絕對(duì)值為0.003，結(jié)果說(shuō)明該模型能夠較好地反映在該消解條件理論值與計(jì)算值之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)獲得的消解優(yōu)化條件是可信的。

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，對(duì)一些土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在優(yōu)化的消解條件下獲得的氮含量測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較，對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表4，其對(duì)數(shù)誤差絕對(duì)值均小于0.1，更進(jìn)一步證明了在優(yōu)化條件下進(jìn)行消解得到的結(jié)果是可靠的，方法具有普遍的應(yīng)用意義。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)比

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，考察了凱氏定氮法中試樣料液比、消解溫度和消解時(shí)間三因素對(duì)氮含量測(cè)定的影響。二次方程的模型回歸顯著，且失擬性檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明通過(guò)本實(shí)驗(yàn)所建立的二次回歸方程可以反映所考察的三個(gè)因素與響應(yīng)值之間的非線(xiàn)性關(guān)系，試驗(yàn)設(shè)計(jì)科學(xué)合理。由回歸方程所做的響應(yīng)曲面圖對(duì)凱氏定氮法進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，從中確定了最佳因素水平范圍，通過(guò)計(jì)算得到的最優(yōu)條件是：物料比為0.3∶5(g/mL)，在260℃下消解60 min，在此條件下得到氮的含量實(shí)驗(yàn)平均值為1310×10-6，實(shí)驗(yàn)值與標(biāo)準(zhǔn)值(1300×10-6)的對(duì)數(shù)誤差絕對(duì)值為0.003。將該條件應(yīng)用于多目標(biāo)地球化學(xué)調(diào)查樣品氮元素的分析，可以準(zhǔn)確控制消解溫度和消解時(shí)間，提高分析效率，并且測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠，對(duì)于大批次的樣品同時(shí)測(cè)定具有實(shí)用意義。

凱氏定氮法包括三個(gè)部分：消解反應(yīng)、蒸餾、滴定。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的消解條件涉及料液比、消解溫度和消解時(shí)間三個(gè)因素，而僅僅對(duì)消解條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能保證完全準(zhǔn)確。在實(shí)際生產(chǎn)中，消解條件中加入混合加速劑的用量[12]、控制蒸餾過(guò)程中蒸汽的流速和酸堿的污染、滴定誤差等實(shí)驗(yàn)條件對(duì)于結(jié)果的準(zhǔn)確性同樣重要，這些條件的優(yōu)化選擇可在以后的工作中繼續(xù)探索。

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