梁峰，孫炳偉，王旭，秦魏婷，劉大東，仇雪楓

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

外源性一氧化碳釋放分子2對(duì)膿毒癥小鼠肝臟能量代謝的調(diào)控作用及機(jī)制

梁峰，孫炳偉，王旭，秦魏婷，劉大東，仇雪楓

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：觀察膿毒癥小鼠肝臟能量代謝的變化，同時(shí)探討外源性一氧化碳釋放分子2（carbon monoxide-releasingmolecules-2，CORM-2）對(duì)其調(diào)控及作用機(jī)制。方法：將48只C57BL／6小鼠隨機(jī)均分成對(duì)照組，盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）組，CORM-2組，無(wú)活性CORM-2（inactivated CORM-2，iCORM-2）組。采用CLP術(shù)制作膿毒癥模型，對(duì)照組不作任何處理，CORM-2組和iCORM-2組除術(shù)后使用CORM-2或無(wú)活性CORM-2外，其余處理同CLP組，術(shù)后72 h內(nèi)連續(xù)監(jiān)測(cè)各組12只小鼠血糖濃度的動(dòng)態(tài)變化及存活情況。另選32只小鼠分組同上，術(shù)后24 h收集肝臟組織及血漿，檢測(cè)肝組織的18F-FDG分布、葡萄糖激酶活性、乳酸含量，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血漿丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT），天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）。結(jié)果：與對(duì)照組比較，CLP組葡萄糖代謝水平增強(qiáng)，葡萄糖激酶、AST、ALT活性以及乳酸含量均明顯增高（P均＜0.05）；CORM-2干預(yù)后上述指標(biāo)明顯降低（P均＜0.05）。與對(duì)照組比較，各手術(shù)組小鼠血糖在術(shù)后36 h內(nèi)持續(xù)下降，且組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：CORM-2能明顯減少膿毒癥小鼠肝18F-FDG攝取、葡萄糖激酶活性和乳酸含量，從而改善膿毒癥小鼠肝臟能量代謝紊亂，提高生存率。

一氧化碳釋放分子2；膿毒癥；肝臟；18F-FDG

膿毒癥是由感染引起的炎癥反應(yīng)綜合征，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克及多器官功能障礙，病死率仍居高不下［1］。肝臟能量代謝紊亂是導(dǎo)致膿毒癥高病死率的重要原因。在膿毒癥早期就可出現(xiàn)血糖升高，并且與預(yù)后密切相關(guān)［2］。我們的前期研究已證實(shí)外源性一氧化碳能抑制膿毒癥時(shí)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的多器官功能衰竭［3－4］，但其對(duì)膿毒癥時(shí)肝臟能量代謝紊亂的調(diào)控作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用小鼠盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and puncture，CLP）制備膿毒癥模型，尾靜脈注射外源性一氧化碳釋放分子2（carbon monoxide-releasing molecules-2，CORM-2）進(jìn)行早期干預(yù)，觀察膿毒癥時(shí)小鼠肝臟能量代謝的變化，同時(shí)探討CORM-2對(duì)其影響并分析作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

γ計(jì)數(shù)器（PE／1470Wizard，美國(guó)PE公司）、VMR小動(dòng)物麻醉機(jī)（美國(guó)Matrx公司）、酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Device公司）。CORM-2（美國(guó)Sigma公司）使用前溶于二甲基亞砜，濃度為10 mmol／L，同時(shí)制備無(wú)活性CORM-2（inactivated CORM-2，iCORM-2）。18F-FDG由江蘇省原子能研究所提供。小鼠葡萄糖激酶和乳酸試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。其他試劑如無(wú)特殊注明均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 小鼠膿毒癥模型的制作及樣本采集

C57BL／6雄性小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由江蘇大學(xué)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分成4組，每組12只，分別為對(duì)照組、CLP組、CORM-2和無(wú)活性CORM組（iCORM-2組）。小鼠均不限制飲食，室溫（25± 2）℃，濕度45%～65%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？瞻讓?duì)照組未做特殊處理，CLP組小鼠接受CLP手術(shù)。在小鼠持續(xù)吸入2%異氟烷麻醉情況下，于其腹壁逐層切開(kāi)2 cm創(chuàng)口，輕柔提起盲腸并于末端約1 cm處用3號(hào)絲線結(jié)扎，16號(hào)針頭于結(jié)扎遠(yuǎn)端穿孔，避開(kāi)較大血管并擠出適量腸腔內(nèi)容物。原位回復(fù)盲腸，腹腔注射37℃生理鹽水約1 mL。逐層縫合腹壁。其他手術(shù)組亦進(jìn)行CLP手術(shù)并分別給予尾靜脈注射CORM-2或iCORM-2（8mg／kg）。CORM-2注射濃度參考以往小鼠實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道及我們課題之前的研究中所使用的濃度［3，5］。手術(shù)24 h后異氟烷吸入麻醉下心臟穿刺收集血液并完整提取肝臟，組織標(biāo)本每份稱(chēng)取0.1 g，加入1 mL PBS后冰上超聲波裂解2次，每次30 s［5］。組織勻漿4℃低溫離心（12 000 r／min），取上清，－70℃保存。

1.3 小鼠生存率的檢測(cè)

各受試小鼠術(shù)后分組飼養(yǎng)，不限飲食，每6 h觀察并記錄小鼠活力及死亡情況，持續(xù)72 h。

1.4 小鼠血糖的測(cè)量

分別檢測(cè)并記錄各組小鼠在術(shù)前及術(shù)后1，2，4，6，8，10，12，16，20，24，36，48，72 h的血糖值。檢測(cè)時(shí)剪去小鼠尾部尖端2～3 mm，按摩擠壓少許血液（0.5～10μL）于血糖試紙檢測(cè)孔，用快速血糖儀讀取數(shù)值。

1.5 小鼠肝臟18F-FDG生物分布檢測(cè)

各實(shí)驗(yàn)組小鼠在檢測(cè)前禁食24 h。尾靜脈注射18F-FDG 20μCi，60 min后全部小鼠斷頸處死，取完整的肝臟組織逐一稱(chēng)重后使用γ計(jì)數(shù)儀檢測(cè)組織放射性同位素示蹤劑18F-FDG含量，通過(guò)對(duì)組織重量的標(biāo)準(zhǔn)化，并計(jì)算放射性同位素的注射衰變時(shí)間，從而得出每只小鼠的標(biāo)準(zhǔn)化放射攝取值（SUV）。計(jì)算結(jié)果經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到最后的SUV值［6］。

1.6 小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶，葡萄糖激酶及乳酸含量的檢測(cè)

日本奧林巴斯公司AU2700全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性。肝細(xì)胞葡萄糖激酶活性和乳酸的含量通過(guò)使用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)，方法參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

信息化管理是市政工程造價(jià)控制與管理的重要實(shí)現(xiàn)途徑，而且我國(guó)政府也比較重視信息化，也相繼推出了一系列的優(yōu)惠政策來(lái)推動(dòng)信息化管理的實(shí)施和信息化工程的建設(shè)。但在我國(guó)現(xiàn)階段的實(shí)施過(guò)程中，往往會(huì)出現(xiàn)工程造價(jià)不能得到真正意義的普及，而其中則存在兩方面的原因：①信息化工程造價(jià)居高不下；②缺乏完善、系統(tǒng)的工程信息化的配套政策；有很多市政施工單位的經(jīng)營(yíng)理念、施工方法技術(shù)、管理模式都比較傳統(tǒng)，也比較落后，這也導(dǎo)致其管理機(jī)制比較僵化，很難適應(yīng)當(dāng)下社會(huì)；很多施工單位都沒(méi)有進(jìn)行信息化管理，也沒(méi)有相應(yīng)的技術(shù)水平，缺乏信息化管理系統(tǒng)等，這些都是信息化管理問(wèn)題出現(xiàn)的原因。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的生存率

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)4個(gè)受試組共48只小鼠72 h的觀察顯示，CLP小鼠24 h的生存率僅為33%，48 h僅為25%。相比之下，使用CORM-2干預(yù)后的小鼠24 h生存率為72%，48 h的生存率達(dá)60%，甚至72 h后仍有20%小鼠存活。見(jiàn)圖1。

圖1 4組小鼠生存曲線的比較

2.2 CORM-2對(duì)膿毒癥小鼠血糖濃度的影響

CLP術(shù)后每2 h檢測(cè)小鼠血糖，持續(xù)36 h。對(duì)照組小鼠血糖無(wú)明顯改變，CLP組小鼠血糖在CLP術(shù)后持續(xù)降低，術(shù)后36 h下降約63%，CORM-2組和iCORM-2組小鼠未能明顯改善CLP術(shù)引起的血糖降低（P均＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 CORM-2對(duì)CLP小鼠血糖濃度的影響

2.3 CORM-2對(duì)膿毒癥小鼠肝臟葡萄糖代謝的影響

CLP術(shù)后24 h，應(yīng)用γ計(jì)數(shù)儀檢測(cè)小鼠肝臟18F-FDG生物分布。結(jié)果顯示，對(duì)照組SUV值為（0.75±0.17）ID%／g，CLP組為（1.94±0.54）ID%／g，CORM-2組為（1.04±0.16）ID%／g，iCORM-2組為（3.57±0.69）ID%／g。CLP組和iCORM-2組的18F-FDG分布明顯高于另外兩組（P均＜0.05）。

2.4 CORM-2對(duì)肝臟葡萄糖激酶活性及乳酸含量的影響

CLP術(shù)后24 h，與對(duì)照組比較，CLP組和iCORM-2組肝臟葡萄糖激酶活性及乳酸含量均明顯增高（P＜0.05）；與CLP組比較，CORM-2組肝臟葡萄糖激酶活性及乳酸含量明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 4組小鼠肝臟葡萄糖激酶的表達(dá)及乳酸含量的比較n＝8±s

表1 4組小鼠肝臟葡萄糖激酶的表達(dá)及乳酸含量的比較n＝8±s

a：P＜0.05，與對(duì)照組比較；b：P＜0.05，與CLP組比較

組別 葡萄糖激酶（U／g） 乳酸（mmol／L）4.60±2.10 0.24±0.020 CLP組 6.38±0.56a 0.40±0.017a CORM-2組 4.74±0.14b 0.25±0.019b iCORM-2組 7.62±0.48a 0.31±0.016a F值 27.634 34.887 P值對(duì)照組0.001 0.001

2.5 CORM-2對(duì)血清ALT和AST活性的影響

CLP術(shù)后24 h，與對(duì)照組比較，CLP組和iCORM-2組血清ALT和AST均明顯增高（P均＜0.05）；與CLP組比較，CORM-2組ALT和AST均明顯降低（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的比較 n＝8±s

表3 各組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的比較 n＝8±s

a：P＜0.05，與對(duì)照組比較；b：P＜0.05，與CLP組比較

組別 ALT（U／L） AST（U／L）43.23±2.94 86.12±6.02 CLP組 112.61±9.74a 380.78±16.34a CORM-2組 63.67±12.23b 200.19±11.09b iCORM-2組 121.79±8.29a 389.48±15.84a F值 37.975 278.916 P值對(duì)照組0.001 0.001

3 討論

臨床研究證實(shí)，膿毒癥時(shí)肝臟能量代謝紊亂，表現(xiàn)為葡萄糖、蛋白質(zhì)、脂肪等需求加大，導(dǎo)致機(jī)體處于高代謝水平［7］。其中，由于無(wú)氧酵解增加以及肝糖原合成能力下降所引起的高血糖，導(dǎo)致重要器官的功能損害，與患者預(yù)后不良密切相關(guān)。一方面，高血糖降低了中性粒細(xì)胞活性，削弱了機(jī)體的免疫功能，使機(jī)體抗感染能力下降；另一方面高血糖能影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增加了腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素6的釋放，減少了內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成［8］。

內(nèi)源性一氧化碳（CO）是由血紅素經(jīng)血紅素加氧酶（HO）催化分解而產(chǎn)生，具有明顯的抗炎、抗凋亡等作用［9］。既往采用吸入的方法作為外源性CO的來(lái)源，但其裝置復(fù)雜、吸入濃度難以控制，易導(dǎo)致碳氧血紅蛋白血癥（HbCO）。CORM-2是近幾年新合成的外源性CO釋放分子，溶解后能緩慢釋放CO，從而發(fā)揮生理作用。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CLP小鼠血糖在術(shù)后2 h開(kāi)始逐漸下降，至36 h時(shí)已降低63%。使用CORM-2干預(yù)后并沒(méi)有改變這一情況。我們認(rèn)為出現(xiàn)這一情況的主要原因可能是由于手術(shù)后小鼠的攝食行為明顯減低，作為代謝能力本身比較旺盛的嚙齒類(lèi)動(dòng)物，在創(chuàng)傷后所需要的能量更是顯著增高，因而短時(shí)間的禁食即可能出現(xiàn)明顯低血糖。Barkhausen等［10］在2009年報(bào)道過(guò)該現(xiàn)象。這有沒(méi)有可能是因?yàn)槟摱景Y嚴(yán)重感染，導(dǎo)致代謝能力下降所引起？是否和之前所研究的膿毒癥患者全身高代謝征的理論相悖呢？本實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)此做了進(jìn)一步的研究。18FFDG作為一種類(lèi)葡萄糖放射性示蹤劑，可以顯示組織器官受到各種疾病或藥物的影響時(shí)葡萄糖代謝水平的變化，目前已被應(yīng)用于人及小動(dòng)物糖代謝的研究［11］。18F-FDG被細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT）運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，通過(guò)HK磷酸化為18F-2′-FDG-6，繼而不能像G-6-P那樣繼續(xù)進(jìn)行糖代謝而是被滯留在細(xì)胞內(nèi)，因此，其含量就代表了細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝葡萄糖的能力?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DG高攝取的情況不僅僅發(fā)生在惡性腫瘤，許多良性的炎性反應(yīng)也常常表現(xiàn)出高FDG攝取現(xiàn)象［11］。我們檢測(cè)18FFDG生物分布，發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠的肝臟葡萄糖代謝水平明顯增高，超過(guò)了正常水平，而使用CORM-2干預(yù)后其葡萄糖代謝能力則受到了明顯的抑制。

葡萄糖激酶是葡萄糖代謝的關(guān)鍵酶，主要存在于動(dòng)物肝細(xì)胞及胰島B細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，其活性的增高常常意味著葡萄糖代謝水平的增高。通過(guò)對(duì)膿毒癥小鼠肝細(xì)胞葡萄糖激酶活性的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)膿毒癥時(shí)葡萄糖激酶活性較對(duì)照組明顯增高，而CO干預(yù)后這一改變受到明顯抑制。由此，我們推測(cè)，CORM-2可能是通過(guò)抑制葡萄糖激酶的活性，降低了肝細(xì)胞葡萄糖代謝水平。

膿毒癥時(shí)異常代謝的另一個(gè)重要變化就是高乳酸代謝，這是激素和細(xì)胞因子的反向調(diào)節(jié)異常而引起的肌肉及其他組織無(wú)氧酵解過(guò)程增加所引起的，這一過(guò)程被稱(chēng)為乳酸穿梭。組織中乳酸含量的高低和持續(xù)時(shí)間直接影響后期器官功能障礙的形成，乳酸堆積所引起的酸中毒對(duì)于膿毒癥預(yù)后也是極為不利的［7］。機(jī)體清除乳酸最主要的器官就是肝臟。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CORM-2干預(yù)后的膿毒癥小鼠肝臟乳酸堆積明顯受抑，這也是CORM-2調(diào)控膿毒癥小鼠肝臟能量代謝的一個(gè)重要機(jī)制。

因此，CORM-2通過(guò)調(diào)節(jié)膿毒癥小鼠肝臟葡萄糖代謝、組織乳酸含量及轉(zhuǎn)氨酶活性，改善了肝臟能量代謝，從而使膿毒癥小鼠的生存率明顯提高。本研究初步證實(shí)了CORM-2對(duì)膿毒癥時(shí)肝臟能量代謝紊亂的調(diào)控作用，后期，我們將進(jìn)一步對(duì)CORM-2干預(yù)能量代謝中脂肪和蛋白質(zhì)的代謝進(jìn)行研究。

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Effect of CORM-2 on liver energy metabolism in sepsis and the potentialmechanism s

LIANG Feng，SUN Bing-wei，WANG Xu，QINWei-ting，LIU Da-dong，QIU Xue-feng

（Department of Burn and Plastic Surgery，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To explore the effects of CO-releasing molecules［tricarbonyl dichlororuthenium（Ⅱ）dimer，CORM-2］-liberated CO on liver energymetabolism of septic model and potentialmechanisms.M ethods：Forty-eightmice were randomly divided into four groups：control group，CLP group，CORM-2 group，inactivated CORM-2（iCORM group），cecal ligation and puncture（CLP）group.The CORM-2 and iCORM-2 group were treated with CLP surgery then followed by tail vein injection of8 mg／kg CORM-2 and iCORM-2，respectively.Twelvemice in each group were used during the experiments of blood glucose testing and survival ratemeasurement.In the other experiment，eightmicewere used in each group.Levels of aminotransferases（ALT and AST）were measured by biochemicalmethods.Glucokinase activity and the concentration of lactate in tissue homogenateswere assessed using assay kits.Blood glucose ofmice in each groupswas tested every 2 hourswithin 36 hours using a fast blood glucose testmeter.Aγcounter was used to detect the biodistribution of18F-FDG in the liver ofmice.Results：The survival rate of septic mice was significantly increased by CORM-2.The uptake of18F-FDG was decreased when treated with CORM-2.The activity of glucokinase，AST，ALT and concentration of lactate in septic mice treated with CORM2 were maintained in normal levels.The blood glucose of septicmicewas decreased significantly in all the three op-eration groups.Conclusion：CORM-2-released CO improves the survival of septic mice by modulating the metabolism of glucose septic mice and protecting the function of liver in sepsismice.

carbon monoxide-releasingmolecules-2；sepsis；liver；18F-FDG

R631

A

1671－7783（2014）01－0018－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130248

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30772256，81071546，81272148）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK2012703）

梁峰（1983—），男，碩士研究生；孫炳偉（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：sunbinwe＠hotmail.com

2013－10－30 ［編輯］陳海林