金镠洋，嚴沁，盧春

（南京醫(yī)科大學微生物學與免疫學系，江蘇南京210029）

KSHV vFLIP在血管內皮細胞中的表達及其功能驗證

金镠洋，嚴沁，盧春

（南京醫(yī)科大學微生物學與免疫學系，江蘇南京210029）

目的：構建含卡波氏肉瘤相關皰疹病毒（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）編碼的病毒FLICE抑制蛋白（viral FLICE inhibitory protein，vFLIP）基因的重組慢病毒表達載體，獲得穩(wěn)定表達vFLIP的人臍靜脈內皮細胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），并檢測vFLIP在HUVECs中活化NF-κB信號通路的能力。方法：以真核表達質粒pEF-vFLIP為模板擴增vFLIP基因，插入至慢病毒載體pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green中構建重組質粒pHAGE-vFLIP。利用脂質體將其與包裝質粒psPAX2和包膜質粒pMD2.G共轉染293 T細胞，收集過濾后的培養(yǎng)上清獲得慢病毒懸液。利用梯度稀釋法測定病毒滴度后，以一定感染復數(shù)的慢病毒感染HUVECs，通過蛋白質印跡法檢測vFLIP的表達。經綠色熒光蛋白（GFP）流式分選以及蛋白質印跡法驗證獲得穩(wěn)定表達vFLIP的HUVECs。最后，通過蟲熒光素酶報告實驗檢測NF-κB的活性，免疫熒光染色檢測NF-κB亞基p65的細胞定位，蛋白質印跡法檢測IκBα蛋白的表達來評價穩(wěn)定表達vFLIP蛋白的HUVECs功能。結果：核酸序列測定證實含vFLIP基因的慢病毒表達載體已構建成功。重組慢病毒感染HUVECs后可檢測到vFLIP的表達。通過流式分選獲得了穩(wěn)定表達vFLIP的HUVECs細胞，并且能通過抑制IκBα的降解，阻礙p65入核來活化NF-κB，從而激活經典NF-κB信號通路。結論：成功包裝了含KSHV vFLIP基因的重組慢病毒，并獲得具有激活NF-κB信號通路功能、穩(wěn)定表達vFLIP的HUVECs株。

慢病毒；卡波氏肉瘤；病毒FLICE抑制蛋白；人臍靜脈內皮細胞；核因子-κB

卡波氏肉瘤相關皰疹病毒（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）又稱人類皰疹病毒8型（human herpesvirus 8，HHV-8），屬于γ-2型皰疹病毒，主要感染內皮細胞和淋巴細胞。KSHV是由Chang等［1］于1994年在人類獲得性免疫缺陷綜合征有關的卡波氏肉瘤組織中發(fā)現(xiàn)的。研究證實，KSHV作為卡波氏肉瘤的病原體，同時與以下兩種疾病密切相關，即原發(fā)性滲出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）和多中心卡斯特萊曼?。?］。

卡波氏肉瘤是一種與血管生成密切相關的惡性腫瘤，常見于皮膚、黏膜以及內臟器官。大量的梭形細胞、炎性細胞以及異常增生的新生血管分布在卡波氏肉瘤瘤體組織中［3］。目前已有多個KSHV編碼蛋白被證實具有致瘤特性，包括病毒白細胞介素6（viral interleukin-6，vIL-6）、病毒干擾素調節(jié)因子（viral interferon regulatory factors，vIRFs）、病毒G蛋白耦聯(lián)受體（viral G protein coupled receptor，vGPCR）以及病毒FLICE抑制蛋白（viral FLICE inhibitory protein，vFLIP）等［3－4］。其中，由KSHV K13基因編碼的vFLIP是一個在潛伏期表達的重要致瘤蛋白［4］，結構上與caspase-8／FLICE的前導肽相似。進一步研究發(fā)現(xiàn)，vFLIP并不能抑制caspase-8，而是通過活化核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）信號通路［5－7］，促進細胞的存活、增殖，細胞因子分泌以及腫瘤形成［8－11］。

本課題組先前的研究表明，KSHV編碼的vIL-6能夠通過自分泌和旁分泌方式促進卡波氏肉瘤組織中梭形細胞的主要前體細胞——內皮細胞誘導血管腫瘤形成［12］。鑒于vFLIP同為KSHV重要的致瘤蛋白，本研究構建了含KSHV vFLIP基因的重組慢病毒表達載體，并獲得了穩(wěn)定表達vFLIP的血管內皮細胞株，以期為今后研究vFLIP在內皮細胞誘導血管生成的作用做好實驗準備。

1 材料與方法

1.1 細胞和慢病毒載體系統(tǒng)

人胚腎上皮293 T細胞（HEK 293 T細胞，以下簡稱293 T）和人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）為本室保存。這兩種細胞需要在5%CO2、37℃環(huán)境條件下生長于DMEM中，還需添加滅活胎牛血清（293 T細胞和HUVECs細胞培養(yǎng)密度分別為10%和20%）、鏈霉素（100μg／mL）、青霉素（80 U／mL）和慶大霉素（80 μg／mL）。實驗中所使用的胎牛血清和培養(yǎng)基均為美國Hyclone公司產品。

慢病毒載體pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green、包膜質粒pMD2.G以及包裝質粒psPAX2三者共同構成慢病毒載體系統(tǒng)［12］。含vFLIP基因的真核表達質粒pEF-vFLIP為本室構建并保存［5］。表達海腎熒光素酶的質粒pRL-TK購自美國Promega公司，NF-κB蟲熒光素酶報告質粒由本室保管［6］。

1.2 試劑

質粒小量提取試劑盒、凝膠純化試劑盒為美國Omega公司產品。質粒轉染試劑購買自美國Invitrogen公司。PCR高保真酶Primer STAR HS為大連寶生物工程（TaKaRa）有限公司產品。實驗過程中所用的工具酶、蛋白標準參照物以及核酸標準分子質量參照均為美國Thermo公司產品。PCR引物為上海英濰捷基（Invitrogen）有限公司合成。基因測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成?？?Flag M2單克隆抗體、抗-α-微管蛋白單克隆抗體、抗-IκBα單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司?？?NF-κB p65多克隆抗體為美國Abcam公司產品。Alexa Fluor 555標記的羊抗鼠IgG購自美國Invitrogen公司。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）為中國碧云天公司產品。雙熒光素酶檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 vFLIP基因的擴增和含vFLIP基因重組質粒pHAGE-vFLIP的構建 vFLIP基因上游引物：5′-CTAGCTAGC GCCACC ATGGCCACTT-3′（斜體部分為Kozak序列，下劃線部分為NheⅠ識別序列）；下游引物：5′-CGCGGATCCTCA CTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTC TGGTGTA-3′（斜體部分為Flag標簽蛋白編碼序列，下劃線部分為Bam HⅠ識別序列）。

應用PCR法從pEF-vFLIP質粒中擴增出vFLIP基因。PCR反應條件：94℃變性5 min，然后98℃15 s，58℃30 s，72℃1min擴增25個循環(huán)，最后72℃延伸6 min。獲得的產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收備用。

vFLIP PCR回收產物和慢病毒載體需在37℃條件下進行限制性內切酶NheⅠ、Bam HⅠ雙酶切。酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠純化后用T4DNA連接酶于4℃連接12～16 h。

連接產物轉化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選氨芐西林抗性菌落，獲得重組質粒。經PCR和雙酶切鑒定，并對重組質粒進行基因測序分析。大量提取經序列鑒定正確的重組質粒，命名該質粒為pHAGE-vFLIP。

1.3.2 慢病毒包裝與滴度測定 用pHAGE-vFLIP、psPAX2、pMD2.G 3種質粒共同轉染293 T細胞，將細胞置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10 h后吸棄原培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基以終止轉染。培養(yǎng)24 h后通過熒光顯微鏡可以觀察到綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達。48 h后收集含有病毒顆粒（Lv-vFLIP）的細胞培養(yǎng)上清。陰性對照為慢病毒空載體pHAGE-Mock，所獲得的病毒為Lv-Mock。獲得病毒后按實驗步驟計算病毒滴度［8］。

1.3.3 vFLIP基因在HUVECs細胞中的表達 將HUVECs細胞接種于明膠包被的6孔板中，調整細胞密度為0.5×106／mL，用無血清DMEM培養(yǎng)。24 h后去除培養(yǎng)基，用重組慢病毒Lv-vFLIP或空載體Lv-Mock上清感染HUVECs細胞，8 h后吸棄上清加入新鮮培養(yǎng)基以終止感染。感染72 h后，采用蛋白質印跡法檢測vFLIP在細胞中的表達情況。

1.3.4 穩(wěn)定表達vFLIP的內皮細胞的構建 按“1.3.3”所述方法感染HUVECs細胞。72 h后以未感染的HUVECs細胞為對照，流式細胞儀分選出GFP表達陽性的細胞，置于含20%滅活胎牛血清的DMEM中繼續(xù)培養(yǎng)。獲得的高陽性率感染細胞分別命名為HUVEC-vFLIP和HUVEC-Mock，并提取細胞總蛋白，通過蛋白質印跡法檢測vFLIP在內皮細胞中的表達。

1.3.5 蟲熒光素酶報告實驗檢測NF-κB活性 轉染前24 h將HUVEC-vFLIP細胞和HUVEC-Mock細胞按每孔0.3×105／mL密度接種于48孔板。按LipofectamineTM2000說明書推薦步驟將NF-κB蟲熒光素酶報告質粒與pRL-TK質粒轉染HUVECs細胞。轉染48 h后蟲熒光素酶和海腎熒光素酶可以產生熒光，按照雙熒光素酶檢測系統(tǒng)介紹的方法檢測熒光強度。參照海腎熒光素酶報告質粒熒光強度，以獲得標準化后的蟲熒光素酶報告質?；钚?。

1.3.6 免疫熒光法（immunofluorescence assay，IFA）檢測p65的表達 用0.25%胰酶消化HUVEC-vFLIP和HUVEC-Mock細胞，將重懸細胞分別接種于玻底培養(yǎng)皿中。次日，棄去皿中培養(yǎng)基并用PBS洗滌，待皿自然風干后以冰丙酮固定20 min；PBS洗滌后于37℃以0.5%Triton X-100穿膜30min，0.5% BSA封閉1 h。加入以0.5%BSA 1∶50稀釋的抗-p65單克隆抗體，于4℃孵育過夜。第2天加入以0.5%BSA（1∶200）稀釋的Alexa Fluor555標記羊抗鼠IgG以及DAPI。染色后用Zeiss Axiovert 200 M金相顯微鏡觀測p65定位的變化。

1.3.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，以熒光強度的均數(shù)±標準差±s）表示各組蟲熒光素酶報告質粒活性，采用t檢驗進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PCR擴增vFLIP基因

以pEF-vFLIP質粒為模板，通過PCR技術擴增出vFLIP基因，全長約625 bp（圖1 A），基因大小正確。

2.2 鑒定pHAGE-vFLIP重組質粒

重組質粒經過限制性內切酶NheⅠ、Bam HⅠ雙酶切，產生載體pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green和vFLIP兩個基因片段，大小分別約為4 625 bp和625 bp（圖1 B）。經核酸序列分析軟件DNAssist比對，結果顯示克隆基因序列與基因庫中登記的vFLIP基因序列完全一致，說明重組質粒pHAGE-vFLIP構建成功。

圖1 PCR擴增vFLIP基因以及NheⅠ、Bam HⅠ雙酶切鑒定重組質粒pHAGE-vFLIP

2.3 慢病毒包裝及其滴度的測定

將pHAGE-vFLIP、psPAX2和pMD2.G 3種質粒共轉染293 T細胞，24 h后可以觀察到GFP的表達（圖2）。通過熒光計數(shù)法測得重組慢病毒vFLIP（Lv-vFLIP）滴度和空載體病毒Mock（Lv-Mock）滴度分別約為3×106TU／mL和4×106TU／mL。

圖2 3種質粒共轉染293T細胞36 h后GFP的表達（×100）

2.4 HUVECs內vFLIP的表達

HUVECs細胞經過Lv-vFLIP感染48 h后提取細胞蛋白，以蛋白質印跡法檢測vFLIP蛋白的表達，同時以Lv-Mock作為對照。結果顯示，一條特異性條帶在約22 000處出現(xiàn)，而vFLIP-Flag蛋白的相對分子質量正是22 000（圖3）。這說明Lv-vFLIP能夠有效感染HUVECs細胞，并介導vFLIP蛋白在其中表達。

圖3 重組慢病毒介導vFLIP在HUVECs細胞中的蛋白表達

2.5 穩(wěn)定表達vFLIP的血管內皮細胞株的獲得

用Lv-vFLIP感染HUVECs細胞，并將細胞進行流式分選以獲得GFP陽性率近100%的細胞，即HUVEC-vFLIP細胞。同時以同樣方法獲得的HUVEC-Mock細胞作為對照（圖4）。通過蛋白質印跡法檢測兩種細胞蛋白，發(fā)現(xiàn)HUVEC-vFLIP細胞在約22 000處出現(xiàn)特異性條帶（圖5），提示vFLIP在流式分選后所獲得的HUVEC-vFLIP細胞中獲得穩(wěn)定表達。

圖4 流式分選獲得的HUVEC-vFLIP細胞和HUVEC-M ock細胞（×100）

圖5 蛋白質印跡法檢測兩類細胞中vFLIP的表達

2.6 穩(wěn)定表達vFLIP的血管內皮細胞株的功能驗證

鑒于vFLIP能夠激活經典NF-κB信號通路，我們將NF-κB蟲熒光素酶報告質粒和表達海腎熒光素酶的pRL-TK質粒共轉染HUVEC-Mock和HUVEC-vFLIP細胞。結果顯示，與對照組比較，HUVEC-vFLIP細胞組的蟲熒光素酶報告質粒活性（1.6 ±0.17）明顯高于對照組（1.0±0.12，t＝4.53，P＝ 0.006 9）。這說明穩(wěn)定表達于血管內皮細胞的vFLIP有效活化了NF-κB信號。

進一步采用IFA檢測NF-κB亞基p65在穩(wěn)定表達vFLIP的血管內皮細胞中的定位。如圖6所示，與HUVEC-Mock細胞核中的p65表達量相比，移位進入HUVEC-vFLIP細胞核中的p65明顯增多。提示穩(wěn)定表達于血管內皮細胞的vFLIP能誘導p65的核轉位，從而發(fā)揮活化NF-κB的生物學功能。

進一步提取HUVEC-Mock和HUVEC-vFLIP的細胞總蛋白，采用蛋白質印跡法檢測IκBα蛋白的表達。與對照組比較，HUVEC-vFLIP細胞中IκBα蛋白表達量明顯降低，表明穩(wěn)定表達于血管內皮細胞的vFLIP可通過抑制IκBα的降解，阻礙p65入核，從而激活經典NF-κB信號通路（圖7）。

圖6 穩(wěn)定表達于血管內皮細胞的vFLIP對p65亞基細胞定位的影響（×400）

圖7 IκBα蛋白在HUVEC-M ock和HUVEC-vFLIP細胞中的表達

3 討論

FLIP（FLICE抑制蛋白）的全稱是Fas相關死亡區(qū)域蛋白樣白介素-1β轉換酶抑制蛋白，是新近發(fā)現(xiàn)的一種與惡性腫瘤發(fā)生與轉移侵襲密切相關的凋亡抑制蛋白，能通過抑制Fas以及腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）介導的細胞凋亡促進腫瘤生成［8－9］。FLIP首先是由Thome等［13］在病毒研究中發(fā)現(xiàn)，被KSHV感染的細胞凋亡率明顯低于正常細胞，在其中發(fā)揮關鍵作用的為病毒型FLIP（vFLIP）。隨后研究者們又發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細胞的胞質中有一種類似于vFLIP、呈高水平表達的蛋白，稱為細胞型FLIP（cFLIP）［10］。vFLIP與cFLIP具有一定的同源性，且都能抑制腫瘤細胞凋亡。但是，兩種類型的FLIP之間也存在明顯的區(qū)別。cFLIP主要通過抑制細胞凋亡蛋白caspase-8介導的細胞凋亡來促進細胞分化和腫瘤形成；而vFLIP主要通過誘導經典NF-κB信號通路來促進腫瘤生成［11］。既往研究證明，vFLIP可以與IκB激酶（IκB kinase，IKK）IKKγ結合進而招募IKKα和IKKβ形成復合物，IKK復合物活化后使下游的IκB降解，進而使“囚禁”于胞質的NF-κB二聚體p50／p65釋放進入細胞核，從而調控相關基因轉錄，促進細胞分化與腫瘤形成［14－17］。

vFLIP在卡波氏肉瘤組織中的表達，在促進腫瘤生長和抑制細胞凋亡方面發(fā)揮著一定的作用，而其表現(xiàn)出的功能大多都依賴于NF-κB信號通路［18］。目前研究證實，vFLIP能夠保護KSHV潛伏感染的B淋巴細胞存活，其機制是通過NF-κB信號通路抑制抗IgM誘導的生長阻滯與細胞凋亡［19］，而下調KSHV感染的PEL細胞系中vFLIP的表達則會引起細胞凋亡和壞死［20－21］。鋅指蛋白A20能夠通過抑制腫瘤壞死因子受體相關因子（tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF）和RNAⅢ抑制肽（RNAⅢ-inhibiting peptide，RIP）來阻斷經典NF-κB信號通路，進而降低趨化因子IP-10的表達以抑制vFLIP誘導的細胞增殖［22］。此外，vFLIP還能通過NF-κB信號通路誘導IL-8和CXCL16的分泌［23－24］。vFLIP還可以調控Notch信號通路［25］，同時下調AP-1信號通路來抑制KSHV分子“開關基因”復制轉錄激活因子（replication and transcription activator，RTA）的啟動子活性，進而抑制KSHV的裂解性復制和病毒顆粒的產生［26］。

依賴NF-κB通路的vFLIP能夠促進細胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤的生成。近來的研究表明，vFLIP能夠通過上調zeste基因增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）的表達來促進血管生成［27］。然而目前有關KSHV vFLIP促進卡波氏肉瘤組織中梭形細胞的主要前體細胞——內皮細胞誘導血管生成的分子機制尚不清楚。為此，本研究利用慢病毒載體系統(tǒng)，構建含有vFLIP基因的重組慢病毒，獲得了高陽性率的穩(wěn)定表達vFLIP的HUVECs。通過蟲熒光素酶報告實驗、免疫熒光染色和蛋白質印跡法，證明穩(wěn)定表達vFLIP的HUVECs能有效抑制IκBα的降解，阻礙p65的核轉運，最終活化NF-κB信號。NF-κB二聚體p50／p65轉運進入細胞核后，通過調控哪些基因的轉錄從而導致細胞增殖遷移、血管生成和腫瘤形成，目前尚未可知。本研究所獲得的穩(wěn)定表達KSHV vFLIP，并且具備激活經典NF-κB信號通路功能的HUVECs，為今后進一步研究KSHV vFLIP促進內皮細胞誘導血管生成的分子機制奠定了實驗基礎，同時也有助于闡明卡波氏肉瘤的發(fā)病機制。

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Construction of the recombinant expression lentivirus vector carrying KSHV vFLIP gene and its protein expression in human umbilical vein endothelial cells

JIN Liu-yang，YAN Qin，LU Chun

（Department of Microbiology and Immunology，Nanjing Medical University，Nanjing Jiangsu 210029，China）

Objective：To construct the recombinant lentivirus carrying Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus（KSHV）-encoded viral FLICE inhibitory protein（vFLIP）gene and to obtain human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）stably expressing vFLIP protein.M ethods：The fragment of vFLIP gene from expression plasmid pEF-vFLIP was cloned into the lentivirus vector pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green.Then，the recombinant plasmid pHAGE-vFLIP，packaging plasmid psPAX2 and envelope plasmid pMD2.G were co-transfected into 293 T cells.The filtered culturemediawere harvested and the recombinant lentiviruswas obtained.After detecting the titer of recombinant lentivirus，the expression of vFLIP protein in lentivirus-infected HUVECswas detected byWestern blot.Next，HUVECs stably expressing vFLIPwere obtained by flow cytometry assay（FCM）and verified the expression of vFLIPbyWestern blot.Finally，the functional verificationswere performed in HUVECs stably expressing vFLIP，including detecting the activity of NF-κB by luciferase assay，the location of p65 by immunofluorescence assay（IFA），and the expression of IκBαprotein byWestern blot.Results：The recombinant lentivirus vector containing vFLIPwas constructed successfully，and the expression of vFLIP in HUVECs infected with lentivirus-vFLIPwas detectable.The HUVECs stably expressing vFLIP were gained successfully by FCM，which could inhibit the degradation of IκBαand the translocation of p65 to activate NF-κB pathway.Conclusion：The recombinant lentivirus carrying KSHVvFLIP gene was successfully constructed，and the HUVECs stably expressing vFLIPwith the ability of activating NF-κB pathway were obtained.

recombinant lentivirus；Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus；viral FLICE inhibitory protein；human umbilical vein endothelial cells；NF-κB

R392.11

A

1671－7783（2014）01－0006－06

10.13312／j.issn.1671-7783.y130235

國家自然科學基金資助項目（81371824）

金镠洋（1986—），女，碩士研究生；盧春（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：clu＠njmu.edu.cn

2013－10－17 ［編輯］陳海林