黨勝春，王平江，曾艷華，陳榮芳，王豪，馮舒，崔磊，張建新

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

血管內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎腎損傷的保護(hù)作用

黨勝春，王平江，曾艷華，陳榮芳，王豪，馮舒，崔磊，張建新

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：探討內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）合并腎損傷的保護(hù)作用。方法：通過(guò)共沉淀法制備超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）；密度梯度離心法分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓來(lái)源EPCs；使用SPIO標(biāo)記EPCs；將72只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、SAP組和SPIOEPCs組，采用胰腺被膜下均勻注射5%?；悄懰徕c制作SAP模型。對(duì)照組和SAP組經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水，SPIOEPCs組注射等量的SPIO-EPCs；分別于造模2，6，12 h檢測(cè)各組大鼠血清中淀粉酶、尿素氮、肌酐和腫瘤壞死因子 α（TNF-α）的水平；蘇木精染色觀察腎組織各時(shí)相病理變化及進(jìn)行病理評(píng)分，普魯士藍(lán)染色觀察腎組織各時(shí)相鐵顆粒含量。結(jié)果：SAP組2，6，12 h的血清淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α的水平較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01）；而SPIO-EPCs組均顯著低于SAP組（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，SAP組2，6，12 h腎病理改變明顯加重，腎病理評(píng)分明顯提高（P＜0.05）；與SAP組比較，SPIO-EPCs組腎病理改變明顯減輕，腎病理評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。普魯士藍(lán)染色見(jiàn)SPIOEPCs組在2，6和12 h腎組織血管內(nèi)皮鐵顆粒含量逐漸增多。結(jié)論：移植EPCs可減少炎癥介質(zhì)釋放，減輕SAP腎的血管內(nèi)皮損傷，對(duì)大鼠SAP腎損傷具有保護(hù)作用。

內(nèi)皮祖細(xì)胞；重癥急性胰腺炎；腎損傷；超順磁性氧化鐵；大鼠

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）常引起全身多器官障礙綜合征和全身炎癥反應(yīng)綜合征，具有發(fā)病急、變化快、并發(fā)癥較多等特點(diǎn)。其中，急性腎損傷（acute renal injury，ARI）是SAP時(shí)常見(jiàn)并發(fā)癥，且病死率較高［1］。SAP時(shí)釋放的大量胰源性毒素、炎癥介質(zhì)、多種細(xì)胞因子、血管活性物質(zhì)及微循環(huán)改變引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是導(dǎo)致SAP相關(guān)性腎損傷的重要因素。

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類具有游走特性并能定向增殖分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，首次由Asahara等［2］在研究成體外周血時(shí)發(fā)現(xiàn)，并將細(xì)胞表面標(biāo)志是CD133＋、CD34＋、VEGFR-2＋的細(xì)胞定義為EPCs。大量研究表明，通過(guò)移植EPCs或基因修飾的EPCs在治療缺血性心臟病、腦血管病及周圍血管病等方面具有重要的作用［3－5］。超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）可作為磁共振成像分子探針標(biāo)記EPCs，進(jìn)而檢測(cè)活體內(nèi)細(xì)胞的遷徙、代謝和生物學(xué)行為，為以后移植EPCs治療器官損傷的磁共振成像示蹤奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)移植SPIO標(biāo)記的EPCs到SAP合并ARI大鼠模型中，目的在于探索EPCs能否更有效地保護(hù)SAP合并的腎損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

成年SD大鼠（江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供），淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)BD公司），CD34-FITC抗體、VEGFR-2-PE（美國(guó)Chemcon公司），EPCs培養(yǎng)基（齊氏生物科技有限公司），細(xì)胞消化酶液（齊氏生物科技有限公司），胎牛血清（美國(guó)HyClone公司），?；悄懰徕c（美國(guó)Sigma公司），六水合三氯化鐵（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），七水合硫酸亞鐵（上海試劑二廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SPIO制備 氧化鐵納米粒子的合成并與精氨酸（arginine）偶聯(lián)參考文獻(xiàn)［6－7］制備，采用共沉淀法制備Fe2O3水基磁流體（質(zhì)量濃度為16 g／L），以精氨酸修飾，配成表面帶正電荷的納米 Fe2O3精氨酸水基磁性液體，質(zhì)量濃度調(diào)整為2 g／L。1.2.2 大鼠骨髓EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 大鼠骨髓EPCs的制備參照文獻(xiàn)［8］獲取。鑒定方法采用CD34、VEGFR-2表達(dá)的免疫熒光染色；EPCs培養(yǎng)2 d后，取部分EPCs，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗去固定液。分別加入15μL 0.2 mg／mL的抗鼠FITC-CD34和FITC-VEGFR-2，濕盒避光孵育2 h后，將PBS作為空白對(duì)照。PBS將多余抗體洗去，60%緩沖甘油封片后置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.2.3 SPIO標(biāo)記EPCs 將SPIO加入第5代EPCs細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行標(biāo)記，SPIO的終質(zhì)量濃度為25 μg／mL，置培養(yǎng)箱內(nèi)再孵育24 h，PBS洗滌3次以去除未進(jìn)入細(xì)胞的鐵離子，37℃培養(yǎng)48 h后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備成密度為4×109／L的細(xì)胞懸液并備用，測(cè)細(xì)胞標(biāo)記率＞95%。

1.2.4 動(dòng)物模型與分組及標(biāo)記的EPCs移植 SD大鼠72只，體質(zhì)量250～300 g，雌雄不限，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁飲。SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、SAP組、SPIO-EPCs組。各組術(shù)后又分為2，6，12 h組，每組8只。按20 mg／kg體質(zhì)量計(jì)算肌注氯胺酮進(jìn)行麻醉，SAP組和SPIO-EPCs組麻醉后采用胰腺被膜下均勻注射5%牛磺膽酸鈉制作SAP模型［9］，對(duì)照組則用等量生理鹽水注射，關(guān)腹。

取備用的SPIO-EPCs懸液，無(wú)菌PBS稀釋懸液至2×109／L［10］。SPIO-EPCs組制模后尾靜脈緩慢注射0.4 mL SPIO-EPCs懸液，對(duì)照組和SAP組尾靜脈緩慢注射等量PBS。每組于2，6及12 h后分別抽取血樣及組織學(xué)觀察。

1.2.5 標(biāo)本測(cè)定 每組分別于2，6及12 h各時(shí)相點(diǎn)取大鼠腸系膜上靜脈血液5 mL，3 000 r／min離心10 min，取上層血清－20℃保存。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清淀粉酶、尿素氮、肌酐；采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）方法檢測(cè)TNF-α，嚴(yán)格按照其試劑盒說(shuō)明操作測(cè)定。

1.2.6 組織病理學(xué)檢查 分別于移植后2、6及12 h，取大鼠左腎（其中12 h后SAP組大鼠死亡2只，死亡率為25%），PBS清洗后，置于10%中性甲醛溶液中固定15～20 h，經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟等過(guò)程制成蠟塊。蘇木精（HE）染色，光鏡下觀察腎組織病理變化；普魯士藍(lán)染色，光鏡下觀察各組腎組織鐵顆粒情況。腎組織損傷評(píng)分參照文獻(xiàn)［11］。每張切片隨機(jī)選取20個(gè)視野，對(duì)每個(gè)視野按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行單獨(dú)評(píng)分，20個(gè)視野的平均分?jǐn)?shù)為動(dòng)物的最后病理評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，方差不齊采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，等級(jí)資料用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)法的Man-Whitney檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Fe2O3-精氨酸粒子的制備

產(chǎn)物為近單個(gè)分散的球形納米顆粒，粒度均勻，未見(jiàn)明顯團(tuán)聚，粒徑分布窄，約20 nm。

2.2 EPCs的形態(tài)學(xué)變化及免疫熒光鑒定

分離、培養(yǎng)大鼠骨髓來(lái)源的EPCs 2 d后，光鏡下觀察見(jiàn)細(xì)胞開(kāi)始貼壁，呈長(zhǎng)梭形、三角形、紡錘形或不規(guī)則形樣改變；免疫熒光染色可見(jiàn)經(jīng)FITC標(biāo)記的CD34，VEGFR-2染色的細(xì)胞表面呈綠色熒光，表達(dá)均為陽(yáng)性。

2.3 移植EPCs預(yù)處理對(duì)SAP大鼠血清淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α的影響

SAP組2，6及12 h的淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α水平較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01）；SPIOEPCs組血清淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α水平均顯著低于SAP組（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 移植EPCs預(yù)處理對(duì)SAP大鼠血清淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α的影響

2.4 病理變化

2.4.1 腎組織學(xué)改變 大體觀察：對(duì)照組腎臟及腎臟周圍脂肪組織結(jié)構(gòu)基本正常，SAP組2 h腎臟無(wú)明顯肉眼改變；6 h腎臟稍腫脹，被膜緊張，表面有散在出血點(diǎn)；12 h腎臟腫脹明顯，被膜高度緊張，腎臟表面有大量出血點(diǎn)。SPIO-EPCs組2 h腎臟病理改變不明顯，6 h及12 h腎病理變化較SAP組均明顯減輕。光鏡檢查：對(duì)照組2、6及12 h腎小球結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)異常；SAP組2 h腎小球結(jié)構(gòu)變得稍模糊，間質(zhì)結(jié)構(gòu)界限欠清，間質(zhì)細(xì)胞稍有變性；6 h腎小球結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多紅細(xì)胞；12 h腎小球萎縮，腎小球細(xì)胞形態(tài)破壞，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量紅細(xì)胞；SPIO-EPCs組較SAP組均有明顯的改善。見(jiàn)圖2。

2.4.2 腎組織普魯士藍(lán)染色結(jié)果 SPIO-EPCs組在2，6及12 h腎組織血管內(nèi)皮鐵顆粒含量逐漸增多，說(shuō)明隨著時(shí)間的推移，SPIO標(biāo)記的EPCs定向歸巢到受損傷的腎組織含量逐漸增多。見(jiàn)圖3。

圖2 光鏡下腎組織病理變化（HE×200）

圖3 腎組織普魯士藍(lán)染色（×200）

2.4.3 腎臟組織學(xué)評(píng)分 對(duì)照組腎組織結(jié)構(gòu)正常；與對(duì)照組比較，SAP組腎病理改變明顯加重，腎病理評(píng)分顯著提高（P＜0.05）；與SAP組比較，SPIOEPCs組病理評(píng)分明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 腎臟損傷評(píng)分

3 討論

SAP時(shí)大量的炎癥細(xì)胞被激活，同時(shí)伴隨大量的炎癥因子釋放，導(dǎo)致胰腺及胰外多器官的損傷。ARI是SAP常見(jiàn)并發(fā)癥之一，其主要的病理改變是腎小管的變性壞死。Mangione等［12］研究表明TNF-α是SAP發(fā)生發(fā)展中重要的細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)IL-1和IL-6等產(chǎn)生，促進(jìn)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞合成內(nèi)皮素-1，導(dǎo)致腎血管強(qiáng)烈收縮，加重腎缺血和血栓形成，并使炎性介質(zhì)與氧自由基釋放增多，直接損傷腎組織。Zhang等［13］研究發(fā)現(xiàn)SAP時(shí)釋放的TNF-α通過(guò)Fas／Fasl系統(tǒng)將信號(hào)傳遞至Caspase家族導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，同時(shí)能加強(qiáng)腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞間黏附分子（ICMC-1）釋放，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB和活化蛋白（AP）-1結(jié)合從而引起腎細(xì)胞的凋亡。SAP合并ARI時(shí)由于炎性反應(yīng)引起水電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂，腎小球?yàn)V過(guò)率降低及腎血流量減少，導(dǎo)致尿酸排出減少，加上腎小球內(nèi)膜細(xì)胞下免疫復(fù)合物的形成，胰腺及其周圍炎性病變累及毗鄰的腎臟等，這些機(jī)制都在SAP引起ARI中發(fā)揮了重要的作用。

血管EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，臍帶血、成體外周血及骨髓中均存在能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的EPCs。最近的研究表明EPC在內(nèi)皮損傷或功能不全的修復(fù)中起重要作用［14］。從臍帶血或自身骨髓、外周血中分離EPCs，體外擴(kuò)增后再向體內(nèi)輸注，進(jìn)行定向細(xì)胞治療，這可能成為SAP合并多器官損傷治療的理想方法。Rookmmaaker等［15］研究發(fā)現(xiàn)EPCs對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)具有促進(jìn)作用。Chade等［16］在研究豬腎動(dòng)脈狹窄時(shí)，通過(guò)輸注自體EPCs，發(fā)現(xiàn)腎狹窄血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)增加，并伴有新血管生長(zhǎng)成熟，進(jìn)而減緩了腎微血管重構(gòu)及動(dòng)脈的纖維化。Patschan等［17］發(fā)現(xiàn)腎臟急性缺血時(shí)能夠快速動(dòng)員EPCs到腎髓質(zhì)乳頭部位，使其在腎臟內(nèi)皮細(xì)胞中具有潛在修復(fù)作用。

SPIO在較弱的外磁場(chǎng)中產(chǎn)生巨大的磁性，而當(dāng)磁場(chǎng)撤離后磁性也迅速消失，即所謂的超順磁性，該特性使其成為磁共振成像應(yīng)用較廣的對(duì)比劑之一。利用干細(xì)胞吞噬SPIO來(lái)標(biāo)記其本身，再通過(guò)體外細(xì)胞共培養(yǎng)，從而應(yīng)用磁共振成像技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤。但如何確定鐵濃度的安全有效范圍以有效標(biāo)記EPCs，也是我們研究的重點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞內(nèi)游離的鐵過(guò)多可使細(xì)胞的氧化作用加強(qiáng)，引起過(guò)多的氧化自由基釋放，損傷甚至破壞細(xì)胞［18］。Arbab等［19］研究表明，濃度為25μg／mL SPIO標(biāo)記細(xì)胞不影響其生物活性，且能獲得較好的標(biāo)記效果，但50μg／mL SPIO標(biāo)記則影響其生物活性。

本實(shí)驗(yàn)采用帶正電荷的精氨酸修飾納米化處理的氧化鐵顆粒，通過(guò)培養(yǎng)大鼠骨髓來(lái)源的EPCs，使帶負(fù)電荷的EPCs通過(guò)非特異性膜表面吸收攝取鐵顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，成功標(biāo)記后，將EPCs移植到大鼠SAP合并ARI模型中。通過(guò)檢測(cè)大鼠血清中淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α的含量，同時(shí)觀察腎病理?yè)p傷的變化。結(jié)果表明，移植EPCs治療后，SPIOEPCs組血清淀粉酶、尿素氮、肌酐和TNF-α的含量均較SAP組顯著降低，腎病理?yè)p傷亦顯著降低?；诒緦?shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們做出了如下推斷：SAP腎損傷炎癥反應(yīng)釋放的炎癥介質(zhì)以及多種未知因素能動(dòng)員EPCs進(jìn)入外周循環(huán)，進(jìn)而遷移到受損部位，修復(fù)損傷的內(nèi)皮組織，減少炎癥介質(zhì)的釋放。但EPCs的動(dòng)員、歸巢及修復(fù)血管內(nèi)皮的具體機(jī)制目前尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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Protecting effect of endothelial progenitor cell transplantation on renal injury w ith severe acute pancreatitis

DANG Sheng-chun，WANG Ping-jiang，ZENG Yan-hua，CHEN Rong-fang，WANG Hao，F(xiàn)ENG Shu，CUILei，ZHANG Jian-xin
（Department of General Surgery，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To explore the protecting effect of endothelial progenitor cells（EPCs）transplantation on renal complicated injury with severe acute pancreatitis（SAP）.M ethods：Tomanufacture the superparamagnetic iron oxide（SPIO）by the coprecipitation method；collecting rat EPCs from bonemarrow，mononuclear cellswere isolated with ficoll，VEGF，fibroblast growth factor（FGF）in the culturemedium；EPCswere labeled by the SPIO；72 ratswere randomly divided into control group，SAP group，SPIO-EPCs group.The SAPmodels were established by injection of sodium taurocholate into the pancreatic capsule.Rats in the SPIO-EPCs group were injected with SPIO-EPCs through tail vein.Rats in SAP group and control group only

phosphate buffered solution with the same dose.Then the serum levels of AMS，BUN，Cr and TNF-αat2 h，6 h，12 h aftermodeling.Pathologic alteration of kidney were also observed.HE staining was used to observe the pathologic change of kidney tissue on different time between three groups.Prussian blue staining was used to observe the change of iron particles in SPIO-EPCs group on different time.Results：In SAP group serum levels of AMS，BUN，Cr and TNF-αwere significantly elevated compared with control group（P＜0.01）.Compared with SAP group，serum levels of AMS，BUN，Cr andTNF-αwere significantly decreased in SPIO-EPCs group（P＜0.01）.The pathological scores of renal in SAP group were higher than those of control group（P＜0.05）.The pathological scores of renal in SPIOEPCs group were lower than those of SAP group（P＜0.05）.From the Prussian blue staining，we can observe that the iron particles in renal vascular endothelial increased gradually on the time passed.Conclusion：EPCs transplantation can reduce the release of inflammatory mediators，reduce renal vascular endothelial injury SAP.The transplanting EPCs can alleviate the renal injury with SAP.

endothelial progenitor cells；severe acute pancreatitis；renal injury；superparamagnetic iron oxide；rat

R576

A

1671－7783（2014）01－0001－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y130253

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81070287）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK2011484，BK2012704）

黨勝春（1972—），男，江蘇泗陽(yáng)人，副教授，副主任醫(yī)師，博士，主要從事胰腺炎基礎(chǔ)和臨床研究。

2013－11－12 ［編輯］何承志