Rukhsar Ahmad，蔣鵬程，顧韻，劉嫣方，陳芹，步雪峰，謝黎，林志強(qiáng)，錢煒

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1.耳鼻喉科，2.普外科，3.中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江212002）

不同年齡人群肌肉組織中7種線粒體酶的表達(dá)差異

Rukhsar Ahmad1，蔣鵬程2，顧韻1，劉嫣方3，陳芹3，步雪峰2，謝黎2，林志強(qiáng)1，錢煒1

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1.耳鼻喉科，2.普外科，3.中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：探討年輕人與中老年人肌肉中線粒體電子傳遞鏈和胞質(zhì)中一些關(guān)鍵酶的表達(dá)差異。方法：收集7例年輕人及33例中老年人頸部肌肉標(biāo)本，透射電鏡觀察兩組肌肉中線粒體形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)NADH氧化還原酶輔酶1［NADH dehydrogenase（ubiquinone）1 alpha subcomplex 1，NDUFA1］，琥珀酸脫氫酶復(fù)合體鐵硫亞基（succinate dehydrogenase complex，subunit B，SDHB），細(xì)胞色素b（cytochrome b，Cytb），細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome C oxidase，COX），V型H＋ATP酶（vacuolar-type H＋-ATPase，V-ATPase H），蘋果酸脫氫酶（cytosolic malate dehydrogenase，MDH）、短鏈羥烷基-輔酶A脫氫酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADHSC）的表達(dá)情況。結(jié)果：與年輕人相比，中老年人肌肉中線粒體體積增大，空泡增多，嵴排列紊亂，出現(xiàn)類結(jié)晶狀包涵體；NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H表達(dá)量明顯降低（P均＜0.05），但MDH及HADHSC的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；蛋白質(zhì)印跡結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果相一致。結(jié)論：肌肉組織中線粒體的形態(tài)和關(guān)鍵酶的表達(dá)隨年齡的增加出現(xiàn)明顯改變，可能在衰老過程中起到重要作用。

衰老；肌肉；線粒體；酶

衰老是機(jī)體逐漸退化的過程，其重要特征就是骨骼肌質(zhì)量逐漸丟失，肌肉力量逐漸降低［1－2］。人類一直不斷地探索衰老的原因，早在20世紀(jì)50年代，Harman［3］就提出了衰老的自由基學(xué)說。在之后的幾十年中，衰老的自由基理論逐漸延伸為衰老的線粒體學(xué)說［4］。線粒體在細(xì)胞的能量代謝中起著重要的作用，其通過內(nèi)膜上大量的酶進(jìn)行氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，從而提供能量。骨骼肌中存在大量的線粒體，有研究顯示肌肉衰老與線粒體功能下降之間存在著密切的關(guān)系［5］。盡管如此，線粒體電子傳遞中關(guān)鍵酶和胞質(zhì)中某些重要酶在衰老肌肉中的表達(dá)變化仍不明確。本實(shí)驗(yàn)擬比較線粒體電子傳遞鏈中的關(guān)鍵酶和胞質(zhì)中一些重要酶在年輕人與中老年人肌肉中的差異，探尋線粒體相關(guān)酶在衰老過程中的意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2012年10月至2013年4月于江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院行甲狀腺瘤切除術(shù)患者的頸部肌肉標(biāo)本，共40例。根據(jù)世界衛(wèi)生組織提出的年齡分段，其中，年輕患者（＜44歲）7例，女4例，男3例，年齡為26～39歲，中位33歲；中老年患者（＞45歲）33例，女20例，男13例，年齡為45～74歲，中位57歲。本研究方案獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 材料

兔抗人NADH氧化還原酶輔酶1［NADH dehydrogenase（ubiquinone）1 alpha subcomplex 1，NDUFA1］、琥珀酸脫氫酶復(fù)合體鐵硫亞基（succinate dehydrogenase complex，subunit B，SDHB）抗體及SABC免疫組化染色試劑盒購買于武漢博士德生物工程有限公司。兔抗人細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome C oxidase，COX）抗體購于Cell Signaling生物技術(shù)公司。兔抗人細(xì)胞色素b（cytochrome b，Cytb）、V型H＋ATP酶（vacuolar-type H＋-ATPase，V-ATPase H）抗體，鼠抗人蘋果酸脫氫酶（cytosolic malate dehydrogenase，MDH）、短鏈羥烷基 輔酶A脫氫酶（hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，HADHSC）、β-肌動(dòng)蛋白抗體購買于美國Santa Cruz公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購買于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 透射電鏡觀察線粒體形態(tài)

手術(shù)中切除的新鮮肌肉標(biāo)本立即切成1 mm3左右，5%戊二醛固定，送至南京醫(yī)科大學(xué)分析測(cè)試中心應(yīng)用透射電鏡觀察線粒體形態(tài)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

新鮮肌肉用4%甲醛固定，石蠟包埋。蠟塊行4 μm切片，60℃烘烤30 min，二甲苯脫蠟，依次經(jīng)100%，95%，85%，75%梯度乙醇水化，PBS洗2次，5min／次。用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉15min，蒸餾水洗3次。枸櫞酸鹽緩沖液（pH＝6.0）微波加熱15 min進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后PBS洗5 min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min。甩去多余液體，滴加相應(yīng)的一抗（NDUFA1，1∶100；SDHB，1∶100；Cytb，1∶100；COX，1∶1 000；VATPase H，1∶100；MDH，1∶100；HADHSC，1∶100），并用PBS作為空白對(duì)照，4℃過夜。PBS洗3次，5 min／次。滴加生物素化二抗，室溫孵育20 min。PBS洗3次，5 min／次。滴加鏈霉親和素 生物素 酶復(fù)合物試劑，室溫孵育20 min。PBS洗5次，5 min／次。DAB顯色（鏡下掌握顯色程度）。蒸餾水沖洗。蘇木素復(fù)染1 min，鹽酸乙醇分化。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片鏡檢。用Image J軟件對(duì)切片進(jìn)行圖像分析，分析結(jié)果以平均灰度值作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析

手術(shù)切除的新鮮肌肉切成小塊之后加液氮研磨，RIPA裂解。BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白量一致后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% BSA室溫封閉1 h，然后加入相應(yīng)的一抗，分別為NDUFA1，1∶100；SDHB，1∶100；Cytb，1∶200；COX，1∶1 000；V-ATPase H，1∶200；MDH，1∶200；HADHSC，1∶200；β-肌動(dòng)蛋白1∶5 000，4℃過夜。TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)種屬的二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色液化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。條帶用LAND-1D進(jìn)行灰度掃描。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。用t檢驗(yàn)比較兩組間差異，取95%可信區(qū)間。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肌肉標(biāo)本線粒體形態(tài)比較

透射電鏡結(jié)果顯示，年輕人肌肉中線粒體由內(nèi)、外兩層單位膜包圍而成，外膜較厚，內(nèi)膜較薄，內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成線粒體嵴，呈板層狀排列。與年輕人相比，中老年人肌肉中線粒體體積變大，空泡增多，嵴排列紊亂，出現(xiàn)類結(jié)晶狀包涵體，提示隨著年齡的增加和機(jī)體的衰老，線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。見圖1。

2.2 兩組肌肉標(biāo)本線粒體酶表達(dá)的變化

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，與年輕人肌肉相比，老年人肌肉中NDUFA1、SDHB、Cytb、COX和V-ATPase H表達(dá)明顯下降（P均＜0.05），而MDH和HADHSC兩種酶的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖1 兩組肌肉標(biāo)本線粒體結(jié)構(gòu)（透射電鏡×40 000）

圖2 免疫組化法檢測(cè)兩組肌肉標(biāo)本中7種線粒體酶的表達(dá)

2.3 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)線粒體酶表達(dá)

為驗(yàn)證免疫組織化學(xué)的結(jié)果，我們用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)一步檢測(cè)兩組肌肉中NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H、MDH、HADHSC的含量。結(jié)果顯示，與年輕人肌肉相比，中老年人肌肉中NDUFA1、SDHB、Cytb、COX和V-ATPase H的表達(dá)明顯降低（P均＜0.05），而MDH和HADHSC在兩組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致，見圖3。

3 討論

研究表明，衰老的發(fā)展過程與線粒體功能異常密切相關(guān)［6］。伴隨電鏡等技術(shù)的應(yīng)用，線粒體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)已被全面認(rèn)識(shí)。本研究結(jié)果顯示，中老年人肌肉中的線粒體體積變大，空泡增多，嵴排列紊亂，出現(xiàn)類結(jié)晶狀包涵體，失去了正常線粒體的結(jié)構(gòu)，這些形態(tài)學(xué)上的異常變化與線粒體的功能障礙密切相關(guān)。因此，對(duì)線粒體超微結(jié)構(gòu)的觀察，是判斷細(xì)胞衰老程度的重要指標(biāo)［7－8］。

線粒體ATP的產(chǎn)生主要依靠電子傳遞鏈完成。電子傳遞鏈由NADH泛醌氧化還原酶（復(fù)合體Ⅰ）、琥珀酸泛醌氧化還原酶（復(fù)合體Ⅱ）、細(xì)胞色素C還原酶（復(fù)合體Ⅲ）、細(xì)胞色素C氧化酶（復(fù)合體Ⅳ）和ATP合酶（復(fù)合體Ⅴ）組成［9］。在線粒體呼吸鏈的電子傳遞過程中，電子的化學(xué)位能被復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ所利用，將基質(zhì)中的質(zhì)子泵到膜間隙中，最后質(zhì)子通過ATP合酶回到基質(zhì)中，其電化學(xué)勢(shì)能被用來合成ATP分子。目前對(duì)于線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性隨衰老變化的研究較多，普遍認(rèn)為大多數(shù)酶的活性隨著年齡的增長而降低［10］，但是對(duì)于線粒體呼吸鏈酶表達(dá)變化的研究較少。我們通過對(duì)年輕人和中老年人肌肉中參與呼吸鏈構(gòu)成的關(guān)鍵酶進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)大部分關(guān)鍵酶在衰老肌肉中表達(dá)下降，提示呼吸鏈關(guān)鍵酶的表達(dá)下調(diào)可能是衰老過程中線粒體酶活性降低的原因之一。因此，我們推測(cè)線粒體呼吸鏈酶表達(dá)下降導(dǎo)致線粒體呼吸鏈酶活性降低，從而導(dǎo)致線粒體功能受損，ATP生成減少，氧自由基生成增加，進(jìn)而加速衰老進(jìn)程。然而，也有研究顯示線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體蛋白水平并不隨年齡發(fā)生明顯的變化［11］，與我們的結(jié)果不一致。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)兩組肌肉標(biāo)本中7種線粒體酶的表達(dá)

線粒體除了參與糖代謝提供能量以外，還參與一系列的細(xì)胞活動(dòng)，包括脂肪酸的β氧化，磷脂的生物合成等，因此我們又對(duì)兩組肌肉中MDH和HADHSC兩種酶進(jìn)行了比較。MDH是一個(gè)重要的涉及糖代謝的NAD＋依賴酶，定位于線粒體基質(zhì)內(nèi)，為基質(zhì)標(biāo)志酶，催化L-蘋果酸和NAD＋形成草酰乙酸和NADH。研究顯示，MDH在人類皮膚成纖維細(xì)胞的衰老中起到重要的作用［12］，衰老的成纖維細(xì)胞中MDH減少，敲除MDH會(huì)導(dǎo)致年輕成纖維細(xì)胞出現(xiàn)明顯的衰老表現(xiàn)。然而我們的研究顯示MDH在年輕人和中老年人肌肉中表達(dá)無明顯差異，推測(cè)可能與上述報(bào)道中研究的組織不同有關(guān)。HADHSC也為線粒體的基質(zhì)酶，以二聚體形式存在，參與脂類代謝，對(duì)于短鏈脂肪酸和中間產(chǎn)物的氧化至關(guān)重要，HASHSC缺陷與一系列代謝性疾病密切相關(guān)［13］。目前，關(guān)于HADHSC在衰老中的變化尚未見報(bào)道。本研究中該酶在年輕人與老年人肌肉中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HADHSC可能與衰老的關(guān)系并不密切。

本實(shí)驗(yàn)利用透射電鏡、免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)年輕人和中老年人肌肉中線粒體電子傳遞鏈和胞質(zhì)中一些關(guān)鍵酶的表達(dá)差異，結(jié)果表明線粒體這些關(guān)鍵酶的變化可能在衰老的過程中起到重要的作用。

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Differential expression of seven m itochondrial enzymes in young and old skeletalmuscles

Rukhsar Ahmad1，JIANG Peng-cheng2，GU Yun1，LIU Yan-fang3，CHEN Qin3，BU Xue-feng2，XIE Li2，LIN Zhi-qiang1，QIANWei1

（1.Department of Otolaryngology，2.Department of General Surgery，3.Central Laboratory，Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To study the relationship betweenmuscular function and ageing by comparing the morphologic and enzymatic expressions ofmuscularmitochondrion in differentage groups.M ethods：Specimens of neckmuscleswere collected from 7 young patients and 33 old patientswho underwentneck surgery.Themorphological changes ofmitochondrial were demonstrated by electronic microscope，whereas the expressions of NADH dehydrogenase（ubiquinone）1 alpha subcomplex 1（NDUFA1），succinate dehydrogenase complex（SDHB），cytochrome b（Cytb），cytochrome c oxidase（COX），vacuolar-type H＋－ATPase（V-ATPase H），cytosolic malate dehydrogenase（MDH）and hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase（HADHSC）were detected by immunohistochemical staining and western blotting.Results：Compared with the young patients，themitochondria in elder patients became larger，and had more accumulating vacuoles，cristae abnormalities and intra-mitochondrial paracrystalline inclusions；meanwhile，the expressions of NDUFA1，SDHB，Cytb，COX，V-ATPase H decreased significantly in elder patients than young patients（both P＜0.05）.However，there was no difference in expression of MDH and HADHSC between young ___patients and old patients.These resultswere consistentwith western blotting.Conclusion：Themorphologicand enzymatic function ofmuscularmitochondria degenerated alongwith ageing，whichmight play an important role in ageing.

aging；muscle；mitochondrion；enzymes

R337.1；R339.38

A

1671－7783（2014）01－0022－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130265

江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目（2011-WSN021D）；江蘇省醫(yī)學(xué)科研招標(biāo)立項(xiàng)課題（H201353）；鎮(zhèn)江市科技支撐社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（SH2012042）

Rukhsar Ahmad（1986—），男，碩士研究生；錢煒（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：dwqian＠yahoo.com

2013－11－27 ［編輯］劉星星