胡慧欣，馮丹丹，趙丹，郝亞杰，高超，孫士男，翟賀玲，晏磊

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

A.ferrooxidans 和A.thiooxidans 均為化能自養(yǎng)細(xì)菌，在環(huán)境中普遍存在，但其必須生長(zhǎng)在pH 較低的條件下，二者都能對(duì)還原態(tài)的硫化物進(jìn)行氧化。因此，在氣體的生物脫硫研究中日益受到重視[1]。H2S（hydrogen sulfide），分子式為H2S，有臭蛋味，能溶于水，是一種具有刺激性和窒息性的無色劇毒氣體[2]，在沼氣天然氣等燃?xì)庵型写罅康腍2S，在煤氣造氣冶金等工業(yè)中也有H2S 產(chǎn)生[2-3]。H2S 不僅極大地威脅到人類健康，還能夠腐蝕作業(yè)管道。為此，我國環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，氣體中H2S 的含量不得超過20 mg·m-3，國家環(huán)境衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，H2S 氣體含量在居民區(qū)的空氣中不得超過0.000 01 mg·L-1；在工廠車間不得超過0.01 mg·L-1；在城市煤氣中不得超過0.02 mg·L-1。因此，在生產(chǎn)作業(yè)等各場(chǎng)所中必須對(duì)H2S 進(jìn)行脫硫處理。傳統(tǒng)的脫除H2S 的方法很多，有醇胺法碳酸鹽法砜胺法Claus 法和常溫氧化鐵法等[3-4]。生物脫硫是近些年發(fā)展起來的H2S 處理新技術(shù)，采用微生物將H2S 轉(zhuǎn)化為硫酸或單質(zhì)硫。A.ferrooxidans 以氧化二價(jià)鐵以及還原態(tài)硫的化合物等來獲得能量[5]，A.thiooxidans 則以氧化元素硫及還原態(tài)硫的化合物來獲得能量。因此，這兩種嗜酸微生物在生物浸礦重金屬污染的治理以及煙氣H2S 的脫除等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

研究了A.ferrooxidans 和A.thiooxidans 混合菌系構(gòu)建及其脫除H2S 的性能，在此基礎(chǔ)上獲得脫除H2S 的最佳條件，以期為工業(yè)脫除H2S 提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC23270 和Acidithiobacillus thiooxidans ATCC19377，均購買自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，實(shí)驗(yàn)室活化保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

0K 培養(yǎng)基：（NH4）2SO43 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.1 g，Ca（NO3）20.01 g，蒸餾水1 L，用20%的硫酸調(diào)節(jié)溶液所需pH。

A.ferrooxidans 培養(yǎng)基（9K 培養(yǎng)基）[6]：向0K 培養(yǎng)基中加入FeSO4·7H2O，使其濃度達(dá)到44.3 g·L-1。

A.thiooxidans 培養(yǎng)基[7]：向0K 培養(yǎng)基中加入Na2S2O3·5H2O，使其濃度達(dá)到5 g·L-1。

混菌培養(yǎng)及H2S 脫除用培養(yǎng)基：0K 培養(yǎng)基中加入FeSO4·7H2O 和Na2S2O3·5H2O，使二者濃度分別達(dá)44.3 g·L-1和5 g·L-1。

1.2 混合菌系構(gòu)建

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的A.ferrooxidans 和A.thiooxidans 通過定性濾紙過濾后于4 ℃條件下10 000 rpm 離心15 min，收集菌體，并將其懸浮于pH 2.0 的0K 培養(yǎng)液中，顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。將兩種菌按不同的比例進(jìn)行混合，考察其對(duì)混菌培養(yǎng)基中Fe2+和S2O32-的氧化及對(duì)H2S 的脫除效果。A.ferrooxidans和A.thiooxidans 的數(shù)量比設(shè)計(jì)為4 組，分別Ⅰ（1∶1）、Ⅱ（1∶2）、Ⅲ（1∶3）、Ⅳ（2∶1）?；炀囵B(yǎng)實(shí)驗(yàn)在搖床上進(jìn)行，各組比例混菌懸液接種至混菌培養(yǎng)基中，接種量為10%，培養(yǎng)100 h 后取樣測(cè)定。

1.3 混合菌系脫除H2S

H2S 脫除實(shí)驗(yàn)采用自制反應(yīng)器，取在搖床上培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的混菌培養(yǎng)液，加至反應(yīng)器中，以40 mL·min-1的通氣量通入初始H2S 濃度為8 g·m3-1的氣體，反應(yīng)器運(yùn)行溫度為28 ℃，時(shí)間為3 h。

1.4 分析方法

亞鐵離子測(cè)定采用重鉻酸鉀滴定法分析[8]，細(xì)菌消耗的二價(jià)鐵與二價(jià)鐵總量的比值表示其氧化百分?jǐn)?shù)；S2O32-的氧化能力通過體系pH 來表征；通過H2S檢測(cè)儀測(cè)定H2S 濃度，按下式計(jì)算脫硫率：脫硫率=［（M1-M2÷M1）］×100%，其中M1為氣體進(jìn)入反應(yīng)器時(shí)H2S 的質(zhì)量，M2為反應(yīng)器排氣口氣體中H2S 的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 A.ferrooxidans 和A.thiooxidans 的混合比例對(duì)Fe2+和S2O32-氧化的影響

培養(yǎng)基中含有Fe2+和S2O32-兩種底物，A.ferrooxidans 能利用Fe2+和S2O32-，而A.thiooxidans 只能利用S2O32-，且前者的最佳生長(zhǎng)pH 為2.0～2.5，后者為2.0～2.8，因此，兩種菌數(shù)的不同配伍必將對(duì)底物利用及體系pH 產(chǎn)生影響。圖1 為不同混合比例的細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)基中Fe2+氧化的影響，由圖可知，經(jīng)過100 h的搖床培養(yǎng)后，Ⅱ組混菌Fe2+氧化率可達(dá)99.6%，F(xiàn)e2+氧化率越高體系中Fe3+濃度越高，而Fe3+是強(qiáng)氧化劑，可以氧化H2S 等還原態(tài)硫化物。盡管A.ferrooxidans 在Fe2+和S2O32-雙底物存在時(shí)會(huì)優(yōu)先利用Fe2+，但從實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)隨著A.ferrooxidans 比例的增加，F(xiàn)e2+的氧化率增加。原因可能是，溶液中Fe2+量一定，并且有可溶性的S2O32-存在，當(dāng)A.ferrooxidans 數(shù)量增加時(shí)，有限的Fe2+不能完全滿足大量A.ferrooxidans 的需求，使得A.ferrooxidans 只能利用S2O32-維持生長(zhǎng)。在從圖2 可以看出，體系pH 均從2.0 下降到了1.5 以下，說明各比例組合的細(xì)菌能有效的氧化S2O32-為S2O42-，從而引起體系pH 下降。由圖2 還可以看出，混合菌pH 下降幅度隨A.thiooxidans 比例增加而增大，說明在S2O32-轉(zhuǎn)化為S2O42-過程中，A.thiooxidans 起著主要作用。雖然Ⅲ組pH 最低，但對(duì)于混菌而言，過低的pH 會(huì)影響A.ferrooxidans 和A.thiooxidans 的生長(zhǎng)和活力，從而會(huì)影響到混合菌的脫硫效果，結(jié)合Fe2+氧化情況，我們選擇Ⅱ組為最佳的混合比例。

圖1 細(xì)菌混合比例對(duì)亞鐵氧化率的影響Fig.1 Effects of bacterial mixture ratio on the oxidation of ferrous iron

圖2 細(xì)菌混合比例對(duì)硫代硫酸鈉氧化的影響Fig.2 Effects of bacterial mixture ratio on the oxidation of sodium thiosulfate

2.2 A.ferrooxidans 和A.thiooxidans 的混合比例對(duì)H2S 脫除率的影響

圖3 為不同比例混合菌脫除H2S 的時(shí)間動(dòng)態(tài)，從圖中可以看出，各種組合混合菌的H2S 脫除率隨反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)間的增加而增加，Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ組混菌對(duì)H2S 脫除率增加較為平緩，且增加幅度較小，而Ⅱ組混菌H2S 脫除率在60 min 時(shí)為24.96%，經(jīng)過30 min后，迅速上升至63.68%，到180 min 時(shí)，H2S 幾乎被完全脫除。從圖中還可以得知，H2S 脫除率升高并不依賴于混菌中某一菌數(shù)量的加，而是兩種菌需達(dá)到最佳的協(xié)作狀態(tài)，即A.ferrooxidans 必須及時(shí)有效的將體系中Fe2+氧化為Fe3+，使其能及時(shí)的參與到H2S 的脫除反應(yīng)中，而A.thiooxidans 也必須迅速將溶液中H2S 作為底物進(jìn)行氧化，以便維持體系pH 在2.0 左右，防止由于Fe2+氧化為Fe3+造成的體系pH 上升進(jìn)而產(chǎn)生沉淀，影響H2S 脫除效率。由此我們選擇Ⅱ組為H2S 脫除的混合菌，其在反應(yīng)器中H2S 的脫除率能達(dá)99.2%。

圖3 細(xì)菌混合比例對(duì)H2S 脫除的影響Fig.3 Effects of bacterial mixture ratio on the removal of H2S

3 討論

A.ferrooxidans 和A.thiooxidans 均為化能自養(yǎng)菌，雖然在環(huán)境中普遍存在，但其必須生長(zhǎng)在pH 較低的環(huán)境中，且培養(yǎng)過程中菌體得率不高，但二者都能對(duì)還原態(tài)的硫化物進(jìn)行氧化[9]。因此，在氣體的生物脫硫研究中日益受到重視。當(dāng)A.ferrooxidans 和A.thiooxidans 生長(zhǎng)在同一個(gè)體系中時(shí)，二者必然會(huì)競(jìng)爭(zhēng)利用底物。因此，我們采用Fe2+和S2O32-雙底物培養(yǎng)基用于構(gòu)建和培養(yǎng)混合菌系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，A.ferrooxidans 和A.thiooxidans 在雙底物培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，二者菌體數(shù)量的不同會(huì)引起體系中Fe2+和S2O32-氧化情況的差異，只有當(dāng)二者比例達(dá)到一個(gè)合適值時(shí)，兩者才能協(xié)作利用培養(yǎng)基中的底物，一方面使體系中Fe2+迅速氧化，另一方面利用S2O32-，使細(xì)菌獲得能量生長(zhǎng)，同時(shí)維持體系pH。

通過比較不同比例組合的混合菌對(duì)H2S 脫除的影響，結(jié)果顯示，A.ferrooxidans 和A.thiooxidans 比例為1∶2 的混合細(xì)菌對(duì)H2S 的脫除率最高，其次為1∶1 和1∶3 的組合，而比例為2∶1 的脫除效果最差。采用混合菌脫除H2S，是為了充分利用A.ferrooxidans 和A.thiooxidans 的生理生化共性及特性，兩者都能在同一pH 下生長(zhǎng)和發(fā)揮效能[10]。在研究中，底物中適量的Fe2+可快速激發(fā)A.ferrooxidans 的活性，而獲得的Fe3+又可迅速同H2S 反應(yīng)，提高H2S 的處理效率；底物中S2O32-在移入反應(yīng)器前幾乎全被轉(zhuǎn)化為SO42-，從而能有力的維持H2S 處理液的酸度，而進(jìn)入對(duì)數(shù)期的A.thiooxidans 即可快速利用溶入培養(yǎng)液中的H2S[11]。在A.ferrooxidans 和A.thiooxidans 的共同作用下，體系中H2S 得以處理，并且A.ferrooxidans還可以循環(huán)利用體系中再生的Fe2+，降低處理投入。

［1］劉正輝.東江氨氮污染河段的微生物群落特征［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2011.

［2］TangK，BaskaranV，NematiM.Bacteriaofthesulphurcycle：Anover-viewofmicrobiology，biokineticsandtheirrolein petroleum and mining industries ［J］.Biochemical EngineeringJournal，2009，44（1）：73-94.

［3］SyedM，SoreanuG，F(xiàn)allettaP，etal.Removalofhydrogen sulfidefrom gasstreamsusingbiologicalprocesses［J］.CanadianBiosystemsEngineering，2006，48：21-24.

［4］黃新，朱道平.H2S脫除方法評(píng)述［J］.化學(xué)工業(yè)與工程技術(shù)，2004，25（5）：47-49.

［5］苑璞，苑琳，邵靜，等.氧化亞鐵硫桿菌的分離及其培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.生物技術(shù)，2010，20（2）：47-50.

［6］ArocaG，UrrutiaH，NúezD，etal.Comparisononthe removalofhydrogensulfideinbiotricklingfiltersinoculated withThiobacillus thioparus and Acidithiobacillus thiooxidans［J］.Electronic JournalofBiotechnology，2007，10（4）：514-520.

［7］晏磊，劉權(quán)，張爽，等.響應(yīng)面法對(duì)Acidithiobacillus ferrooxidans 發(fā)酵液脫除H2S的優(yōu)化研究［J］.生物技術(shù)，2012，22（6）：86-88.

［8］YanL，YinHH，ShuangZ，etal.Organoarsenicresistance and bioremoval of Acidithiobacillus ferrooxidans ［J］.BioresourceTechnology，2010，101（16）：6572-6575.

［9］張靜，王清，李曉茹，等.利用硫氧化細(xì)菌改良鹽堿土［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：地球科學(xué)版，2009，39（1）：147-151.

［10］AlexeyBU，AntonMK.Bioleachingoflowgradeuranium ore containing pyrite using A.ferrooxidans and A.thiooxidans ［J］.JournalofRadioanalyticalandNuclear Chemistry，2013，295（1）：151-156.

［11］晏磊，劉權(quán)，張爽，等.氧化硫硫桿菌脫除硫化氫的研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，26（1）：14-17.