鐘建 李夏露

·論著·

益腎活血通絡(luò)法對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟缺氧誘導(dǎo)因子—血管內(nèi)皮生長因子信號通路干預(yù)作用的實驗研究

鐘建 李夏露

目的探討缺氧誘導(dǎo)因子α(hypoxia-inducible factor α，HIF-α)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達的作用機制及微血管損傷發(fā)生的機制及“益腎活血通絡(luò)法”干預(yù)效果，為中醫(yī)藥治療腎間質(zhì)纖維化提供新的依據(jù)。方法實驗采用單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral urethral obstruction，UUO)造成腎纖維化動物模型，并以益腎活血方、氯沙坦灌胃對其進行治療性干預(yù)，分別在術(shù)后第7天、14天、21天采集腎臟標本，運用免疫組化法檢測HIF-α、VEGF在腎臟中的分布、表達。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組、治療組在各時間點HIF-α、VEGF表達均顯著上調(diào)(P<0.01)；在各時間點，益腎活血方組和氯沙坦組較模型組大鼠HIF-α、VEGF表達均下調(diào)(P<0.01)。隨著干預(yù)時間的延長，模型組、治療組HIF-α、VEGF表達都逐漸增強，但增強幅度明顯下調(diào)；益腎活血方組較氯沙坦組大鼠HIF-α、VEGF下調(diào)明顯，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論益腎活血方能有效地降低HIF-α及VEGF表達，改善UUO大鼠內(nèi)源性低氧狀態(tài)，減輕微血管損傷，發(fā)揮抗腎纖維化的作用。

腎纖維化； 血管新生； 益腎活血方； 缺氧誘導(dǎo)因子； 血管內(nèi)皮生長因子

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fabrosis, RIF)是導(dǎo)致各種病因的進展性腎病(progressive renal disease，PRD)進展至終末期腎臟病(end stage renal Disease，ESRD)的共同病理過程。在RIF過程中，腎間質(zhì)微血管病變[主要指腎小管周圍血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的損傷]是最為關(guān)鍵的病理改變，腎微血管損傷和丟失導(dǎo)致局部缺血發(fā)生，可引發(fā)腎間質(zhì)局部低氧狀態(tài)。近年的研究表明，腎間質(zhì)纖維化過程中普遍存在低氧狀態(tài)，間質(zhì)病變過程中的水腫、炎癥、纖維化可增加血氧彌散的距離，而隨著纖維化進展，球后微血管網(wǎng)會不斷受損和減少，使局部的血流量進一步降低，另外低氧能致使腎小球后毛細血管內(nèi)皮細胞的損傷，組織因子的暴露，從而激活外源性凝血途徑，進而加劇血供障礙[1]。此外有研究證明，腎間質(zhì)纖維化的實質(zhì)可能為腎臟微血管的一種炎癥反應(yīng)[2]，減輕腎間質(zhì)微血管的炎癥狀態(tài)能明顯抑制腎間質(zhì)纖維化的進展。綜上所述，局部缺血低氧和微炎癥狀態(tài)的發(fā)生是腎間質(zhì)纖維化進展中最為重要的影響因素。目前尚缺乏針對腎臟微血管損傷治療的現(xiàn)代化學(xué)藥物，而具有“益腎活血通絡(luò)”作用的中醫(yī)藥能有效地減輕腎微血管毀損，從而延緩慢性腎纖維化進程。

1 實驗材料

1.1 動物與分組

雄性成年遠交群(sprague dawley，SD)大鼠96只，體重180～250 g，隨機分為假手術(shù)組、單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral urethral obstruction,UUO)模型組、氯沙坦治療組、益腎活血方治療組各8只，各組觀察時間點均為術(shù)后7天、14天、21天。UUO模型組、益腎活血方組、氯沙坦組大鼠左側(cè)輸尿管取腎門處和輸尿管中上1/3處結(jié)扎，造成單側(cè)輸尿管梗阻模型，假手術(shù)組僅簡單分離單側(cè)輸尿管后行腹部縫合。治療組大鼠晨間分別予灌胃處理直至處死。其余各組予正常飲食飲水直至處死。

1.2 藥物與試劑

益腎活血方：由黃芪15 g、當(dāng)歸15 g、丹參15 g、紅花15 g、大黃15 g、三七15 g組成，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。先將藥材用相當(dāng)于藥材5倍的自來水浸泡2小時，煮沸后再微火煎煮30分鐘，過濾后收集煎液，原藥渣加少量水煎煮，得二煎液。兩煎液混合，于水浴恒溫器上濃縮至濃度為每毫升藥液含生藥1 g。

氯沙坦：即科素亞，由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，批準文號：H20040217。每片50 mg，研磨成粉末，以蒸餾水配成濃度為5 mg/ml溶液備用。

從大鼠術(shù)后第一天開始晨間分別予氯沙坦、益腎活血方灌胃給藥，按照《實驗動物學(xué)》中人與SD大鼠用藥換算公式，氯沙坦、益腎活血方均采用10 ml/kg·d，1次/天，每天晨間經(jīng)灌胃給藥，自術(shù)后第1天開始至大鼠處死當(dāng)天結(jié)束。

2 實驗方法

2.1 大鼠體重、腎臟重量觀察

分別在第7、14、21天觀察各組大鼠的體重、腎臟重量，每組取平均值做統(tǒng)計分析。

2.2 腎功能檢測

各組大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉后，均用10 ml一次性注射器從大鼠腹腔靜脈采集靜脈血，分裝進滅菌離心管，靜置1～2小時后，在高速離心機上進行離心，分離血清，用全自動生化分析儀檢測血尿素氮(Bun)、血清肌酐(Scr)。

2.3 腎組織病理檢測

取腎組織，HE染色、Masson染色，腎小管、腎間質(zhì)病理損害評價辦法：按Raij法評價6項指標[3]：腎小管擴張、萎縮、上皮細胞變性、上皮細胞壞死，腎間質(zhì)纖維化、炎性細胞浸潤。腎小管間質(zhì)損害程度的判定，按Priraini法[4]進行半定量計分：腎小管無病理變化，即沒有腎小管擴張、萎縮、管型、壞死或小管炎癥評0分，輕度病理改變評1分(發(fā)生病變的腎小管范圍<視野的20%～40%)，嚴重評3分(發(fā)生病變的腎小管范圍>視野的40%)。每張標本切片光鏡(移動范圍10 mm×40 mm)隨機選取10個視野，分別計算評分，取其平均值，作為該標本的腎間質(zhì)指數(shù)。

2.4 免疫組化檢測

采用PV二步法免疫組化檢測HIF-α、VEGF蛋白在腎臟的表達。主要操作步驟：將腎臟標本迅速放入10%的甲醛溶液中固定，制作成石蠟切片；切片常規(guī)脫蠟；H2O2中孵育、PBS緩沖液沖洗；切片入緩沖液(pH6)，微波爐加熱，自然冷卻；滴加預(yù)先稀釋的HIF-α、VEGF一抗溶液，4℃環(huán)境中，PBS緩沖液沖洗；滴加0.1 ml Dako K4001、K4002二抗溶液，37℃孵育、PBS緩沖液沖洗；蘇木素復(fù)染；常規(guī)脫水至透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)對HIF-α、VEGF進行免疫組化半定量分析。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 各組大鼠體重變化情況

術(shù)后第7天，各組大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后第14天、第21天，各組大鼠體重均有所上升，但與假手術(shù)組對比，模型組、益腎活血方組、氯沙坦組大鼠體重明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；益腎活血方組和氯沙坦組體重差異不顯著(P>0.05)。21天后，益腎活血方組、氯沙坦組和模型組大鼠體重相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠不同時間點體重變化比較

4.2 各組大鼠腎臟重量變化情況

術(shù)后第7天，與假手術(shù)組對比，其他各組大鼠的腎臟重量均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。術(shù)后第14天，治療組和模型組相比，大鼠腎臟重量減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；益腎活血方組與氯沙坦組相比，大鼠腎臟重量減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后第21天，治療組與模型組相比，大鼠腎臟重量明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

4.3各組大鼠Bun、Scr情況比較

各組結(jié)果顯示：手術(shù)組大鼠血肌酐和尿素氮均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；益腎活血方組和氯沙坦組與模型組相比，血肌酐和尿素氮有所減低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3，表4。

表2 各組大鼠不同時間點腎臟重量

表3 各組大鼠不同時間點血清肌酐(μmol/L)

表4 各組大鼠不同時間點血清尿素氮(mmol/L)

4.4 光鏡下各組大鼠腎組織病理改變的比較

與假手術(shù)組對比，手術(shù)組大鼠腎間質(zhì)損傷程度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，腎間質(zhì)纖維化程度隨著時間的推移而逐漸加強，第7天時最輕，第21天時最重；與模型組比較，益腎活血方組和氯沙坦組腎間質(zhì)損傷程度均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，各時間點內(nèi)，治療組大鼠腎間質(zhì)纖維化的變化趨勢與模型組一致，但隨著時間的推移，腎間質(zhì)纖維化的加重幅度逐漸減小。益腎活血方組和氯沙坦組腎間質(zhì)損傷程度無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表5。

表5 各組大鼠腎間質(zhì)纖維化比較

4.5免疫組化法測定各組大鼠腎組織HIF-α、VEGF蛋白表達的比較

HIF-α的表達：假手術(shù)組HIF-α微量表達，模型組和益腎活血方組、氯沙坦組大鼠第7天時在腎間質(zhì)內(nèi)HIF-α蛋白表達增加，隨結(jié)扎時間的延長表達逐漸增加，第21天時表達最強，主要在腎皮髓質(zhì)交界處，與假手術(shù)組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；益腎活血方組和氯沙坦組較模型組HIF-α表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，治療組隨著干預(yù)時間延長，HIF-α表達逐漸增多，但增長幅度逐漸變??；益腎活血方組和氯沙坦組對比，益腎活血方組HIF-α表達顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表6。

表6 各組大鼠不同時間點腎組織HIF-α

VEGF的表達：假手術(shù)組弱表達。手術(shù)組VEGF主要分布在腎小球足細胞、集合管上皮細胞的胞漿內(nèi)。與假手術(shù)組對比，手術(shù)組VEGF表達上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；益腎活血方組和氯沙坦組較模型組VEGF表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，治療組隨著干預(yù)時間延長，VEGF表達逐漸增多，但增長幅度逐漸變?。灰婺I活血方組和氯沙坦組對比，益腎活血方組VEGF表達顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表7。

表7 各組大鼠不同時間點腎組織VEGF

5 討論

瘀血是由臟腑功能失調(diào)所產(chǎn)生的病理產(chǎn)物，導(dǎo)致瘀血的原因總起來不外乎虛實兩端。因虛致瘀，因瘀而正愈虛；因?qū)嵵吗?，因瘀而邪更戀。且常常表現(xiàn)為虛實相兼之證，這是慢性腎病發(fā)生發(fā)展過程中病機之特點?！蹲x醫(yī)隨筆·虛實補瀉論》[5]中說：“久病必治絡(luò)，其所謂病久則氣血推行不利，血絡(luò)之中，必有瘀凝，故病氣纏延不去，疏其血絡(luò)而病氣可盡也?！睔鉃檠獛洠瑲庑袆t血行，氣虛則血瘀。因此，現(xiàn)代中醫(yī)理論認為血瘀是腎纖維化形成及發(fā)展過程中的重要病理因素。且基于中醫(yī)絡(luò)病理論的研究發(fā)現(xiàn)：絡(luò)脈主要具有濡養(yǎng)周身、互化津血、貫通氣血、通調(diào)經(jīng)氣等功能，在人體氣血津液的輸布環(huán)流中起著重要的樞紐和橋梁作用，而現(xiàn)代研究表明，絡(luò)脈中發(fā)揮最重要作用的孫絡(luò)的生理結(jié)構(gòu)和功能與腎微血管相似[6]。另外，中醫(yī)絡(luò)病理論中將腎纖維化機制歸納為絡(luò)脈瘀阻、絡(luò)脈瘀塞、絡(luò)息成積三種[7]，此三種病機均與血絡(luò)瘀滯相關(guān)，因此，血瘀致腎纖維化與中醫(yī)絡(luò)病理論中脈絡(luò)相關(guān)疾病理論一致。根據(jù)上述病因病機，可以認為，腎纖維化的主要發(fā)病機制為久病成瘀、病久入絡(luò)，血瘀而致脈絡(luò)不通，發(fā)而為病。因此，中醫(yī)以益腎活血通絡(luò)為治法，本實驗的基礎(chǔ)方為：黃芪、當(dāng)歸、丹參、紅花、大黃、三七。方中以黃芪為君藥，味甘，氣微溫，氣薄而味濃，可升可降，陽中之陽也。本方中取其補氣行氣之功效。當(dāng)歸為臣藥，當(dāng)歸味甘而重，故專能補血，其氣輕而辛，故又能行血，補中有動，行中有補，與黃芪合用，能行氣活血而通絡(luò)消瘀。方中大黃為佐藥，性味苦寒，與黃芪合用時取其活血祛瘀之功效，且大黃能瀉下攻積，使?jié)岫拘皻鈴南露?。方中還加入丹參、三七、紅花等活血祛瘀之品，以增強活血化瘀之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，益腎、活血、通絡(luò)之藥能明顯改善局部微炎癥狀態(tài)，促進微血管新生，抑制纖維化的進展，從而達到治療腎間質(zhì)纖維化的目的。

現(xiàn)代關(guān)于腎纖維化機理的研究發(fā)現(xiàn)，腎纖維化是多因素驅(qū)動的病理過程，涉及低氧缺血、微炎癥、氧化應(yīng)激、多種細胞因子的作用及信號級聯(lián)、細胞凋亡、成纖維細胞增殖和活化，以及上皮細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)化等。但是沒有一種細胞能夠獨立完成腎臟纖維化過程，腎臟纖維化是由多種自身細胞和浸潤細胞共同作用和相互影響的結(jié)果[7]。目前研究認為，在腎纖維化的缺氧、缺血損傷中，HIF-α作為血管新生的啟動和調(diào)控因子對VEGF表達具有重要作用，其發(fā)生機制如下：(1)上調(diào)VEGF受體、配體以及NO水平，使血管通透性增加，為血管形成作好準備。(2)降解細胞外基質(zhì)，增加金屬蛋白水解酶活性，為VEGF的生長提供環(huán)境。(3)通過VEGF和整合素，使血管內(nèi)皮細胞由血管芽腔形成血管網(wǎng)。(4)最后通過血管生成素、血小板源性生長因子等作用于基質(zhì)細胞，使新生血管成熟[8]。因此，通過本研究認為，在調(diào)控腎間質(zhì)纖維化進展過程中，HIF-α和VEGF以級聯(lián)信號通路的形式發(fā)揮著積極的作用。在組織或細胞內(nèi)缺氧時，HIF-α是調(diào)節(jié)氧代謝的重要因子，缺氧后HIF-α表達上調(diào)，與VEGF啟動子中的缺氧反應(yīng)元件發(fā)生特異性結(jié)合，增強VEGF生物學(xué)功能的穩(wěn)定性，同時促進VEGF表達、轉(zhuǎn)錄和翻譯。

在本課題中，使用益腎活血中藥方干預(yù)腎間質(zhì)纖維化大鼠，實驗結(jié)果表明，隨著干預(yù)時間越來越長，益腎活血中藥方對大鼠的影響如下：(1)與模型組相比，益腎活血方組大鼠體重隨著時間延長而體重增加越明顯；(2)腎臟重量方面，益腎活血方組腎臟重量與模型組相比，隨著時間延長，增長越不明顯；(3)腎功能方面，隨著干預(yù)時間延長，益腎活血方組大鼠血肌酐、尿素氮增加不明顯，且增幅小于氯沙坦組；(4)腎臟病理腎損傷分數(shù)方面，隨著時間增加，益腎活血方組腎損傷分數(shù)減?。?5)免疫組化檢測方面，隨著干預(yù)時間延長，益腎活血方組與模型組相比HIF-α、VEGF表達下調(diào)，且較氯沙坦組下調(diào)更明顯。以上數(shù)據(jù)顯示，隨著干預(yù)時間的增長，大鼠腎間質(zhì)纖維化的進程得到明顯緩解，而益腎活血方能改善大鼠腎功能，促進組織低氧的改善，使大鼠損傷的微血管能得以恢復(fù)，因此可以推測：(1)益腎活血方及氯沙坦均能減輕腎纖維化微血管損傷，延緩腎小管間質(zhì)纖維化進展，顯著改善腎臟功能；(2)益腎活血方能有效地改善大鼠腎功能，促進組織低氧的改善，使大鼠損傷的微血管能得以恢復(fù)，其機制可能是通過下調(diào)HIF-α的表達，進而減少VEGF的表達，并最終改善UUO大鼠內(nèi)源性低氧狀態(tài)，減輕微血管損傷，發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化的作用。

通過本實驗，初步證明腎纖維化的機理主要是由于腎臟局部內(nèi)源性低氧缺血的發(fā)生。而益腎活血方能改善內(nèi)源性低氧狀態(tài)，達到延緩腎間質(zhì)纖維進展。同時也證明了益腎活血通絡(luò)類中藥對腎纖維化的治療是有效的，為中醫(yī)藥治療腎纖維化提供了強有力的實驗依據(jù)。

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(本文編輯：董歷華)

RegulationofHIF-VEGFsignalingpathwaybyYishenHuoxueherbsinaratUUOmodel

ZHONGJian,LIXia-lu.

Departmentofnephropathy，F(xiàn)irstaffiliatedhospitalofGuangxitraditionalChinesemedicineuniversity,Nanning530023，China

ZHONGJian，E-mail：zhongjian@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the mechanism how hypoxia-inducible factor α (HIF-α)-induced vascular endothelial growth factor (VEGF) leads to microvascular injury, and the efficacy of Yishen Huoxue herbs in treatment of renal interstitial fibrosis, so as to provide references for treatment of renal interstitial fibrosis using traditional Chinese medicine.MethodsRenal fibrosis model of rat was constructed by unilateral urethral obstruction (UUO) and was treated with oral Tongluo Huoxue herbs and losartan. Then kidney specimen was collected at 7, 14 and 21 days after surgery, and expression and distribution of HIF-α and VEGF in kidney were determined by immunohistochemistry.ResultsAt each of the specified time points, HIF-α and VEGF expression levels significantly increased in both the model group and the treated group than in the sham group (P<0.01), but they were lower in the treated group than in the model group (P<0.01). During this period, HIF-α and VEGF levels of both the model group and treated group showed a tendency of falling back to normal, and the decrease was significantly larger in the treated group than in the model group (P<0.05).ConclusionYishen Huoxue herbs can effectively reduce HIF-α and VEGF expression in UUO rat model, thus alleviate the endogenous hypoxia status, reduce microvascular injury, and play an anti-renal fibrosis role.

Kidney fibrosis； Angiogenesis； Yishen Huoxue herbs； Hypoxia-inducible factor α； Vascular endothelial growth factor

廣西區(qū)教育廳面上項目(200710MS020)；廣西衛(wèi)生廳重點課題項目(重200821)；廣西青年基金項目(2010GXNSFB013073)

530023 南寧，廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科

鐘建(1975- )，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療慢性腎臟疾病。E-mail：zhongjian@medmail.com.cn

R285.5

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.01.003

2013-09-18)