崔飛飛，張菊芳，吳海英，宋亞軍，蔣美琴，翁玉英，姜麗萍

壓瘡（又稱壓迫性潰瘍）分淺表性潰瘍和深層潰瘍，2007年美國壓瘡顧問小組（National Pressure Ulcer Advisory Panel，NPUAP）將深層潰瘍重新定義為深部肌肉組織損傷，臨床上稱其為“惡性壓瘡”或“難免性壓瘡”[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，肌肉損傷后其恢復(fù)和細胞凋亡是同步進行的，倘若細胞凋亡持續(xù)存在，則不利于肌肉的恢復(fù)[3]。因此，肌肉細胞凋亡在難免性壓瘡恢復(fù)進程中發(fā)揮重要潛在作用。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細胞損傷在凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，其中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein serine threonine kinase，Akt）/糖原合成激酶3β（glycogen syn-thase kinase3β，GSK3β）信號通路是維持細胞正常生存和功能的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在缺血性損傷和再灌注損傷中起明顯的保護作用[4]。目前在腫瘤、心、腦缺血-再灌注損傷等領(lǐng)域研究較多，但PI3K/Akt/GSK3β信號通路在難免性壓瘡中的研究鮮見報道。本研究通過動物模型來觀察、探討PI3K/Akt/GSK3β信號通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶在難免性壓瘡形成過程中的表達變化及作用。

1 材料和方法

1.1 動物及主要試劑 健康成年雄性SD大鼠54只（上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供），體質(zhì)量320～350 g。大鼠自由飲水、進食，室溫（25±2）℃，分籠喂養(yǎng)?？贵w葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白（CHOP）、Akt、P-Akt、GSK3β、P-GSK3β由Santa Cruz Biotechnology提供，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶12（caspase-12）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抗體從Abcam公司購買，二抗和內(nèi)參抗體分別由上海碧云天生物技術(shù)研究所和武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 動物模型制備

1.2.1 難免性壓瘡（可疑深部組織損傷）判斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：2007年，NPUAP對壓瘡深部肌肉組織損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)：皮下軟組織受到壓力或剪切力的損害，局部皮膚完整但可出現(xiàn)顏色改變?nèi)缱仙蚝旨t色，或?qū)е鲁溲乃?。與周圍組織比較，這些受損區(qū)域的軟組織可能有疼痛、硬塊、滲出、潮濕、發(fā)熱或冰冷（見圖1）。

1.2.2 模型制備及分組：參照王艷艷等[6]的方法制備壓瘡深部組織損傷動物模型，來模擬臨床難免性壓瘡發(fā)生的背景。用10%水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠俯臥于泡沫床墊上，用剪毛刀對其大腿兩側(cè)股薄肌部位進行剪毛，暴露施壓部位。按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組（Con組），1個周期受壓組（1c組）、3個周期受壓組（3c組）、6個周期受壓組（6c組）、9個周期受壓組（9c組）和恢復(fù)期1 d、3 d、5 d、7 d組，每組各6只。各組大鼠體質(zhì)量與Con組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本實驗?zāi)M臨床壓瘡發(fā)生的處理為于大鼠兩側(cè)大腿股薄肌施加22.47 kPa壓力，持續(xù)施壓2 h，放松0.5 h，即1c組（見圖1C-D）。1c組大鼠模擬壓瘡處理1次；3c組大鼠1 d內(nèi)模擬壓瘡處理3次，只處理1 d；6c組大鼠1 d內(nèi)模擬壓瘡處理3次，連續(xù)處理2 d；9c組大鼠1 d內(nèi)模擬壓瘡處理3次，連續(xù)處理3 d；恢復(fù)期組為大鼠9c組后，解除壓力，分別于第1、第3、第5、第7天，觀察局部受壓組織的變化，Con組大鼠未行施壓處理。各組大鼠于施壓處理結(jié)束后給予安樂處死。

圖1 臨床和動物深部組織損傷模型及案例

1.3 檢測方法 在實驗終點，在冰上迅速切取各組受壓中心部位肌肉組織，于4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液中快速洗去血液，用濾紙吸干水分并且剪碎后于 -80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。另取相同部位受壓肌肉組織（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm），4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液洗凈血液后，4%的多聚甲醛-PBS液固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，蠟塊連續(xù)切片5μm厚，進行組織形態(tài)學(xué)分析。凍存的所有樣品于研究結(jié)束時，進行勻漿，離心（4 ℃，12 000 r/min，15 min）收集上清液用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blotting）法 檢測。

1.3.1 組織形態(tài)學(xué)觀察：組織常規(guī)脫蠟，梯度透明，HE染色，用Nikon（TE 2000-U）顯微鏡觀察，NIS Elements圖像采集軟件采集圖像，觀察受壓組和恢復(fù)組在不同階段局部受壓肌肉組織病理學(xué)變化。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法：采用SABC法，常規(guī)設(shè)立陰性對照。3% H2O2處理后熱修復(fù)抗原，5% BSA封閉，一抗（1:400）4 ℃過夜，生物素化二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，鏡下進行定性觀察。每張組織切片在×20物鏡下觀察4個視野（不重復(fù)），計數(shù)陽性細胞核數(shù)，以每平方毫米的陽性細胞核數(shù)（n/mm2）來表示。

1.3.3 Western blotting法：取各組大鼠肌肉組織各200 mg（于冰上進行操作），加入0.5 mL組織蛋白裂解液ZD408，電動勻漿器將組織研碎，4 ℃離心，取上清，按Bradford法測量蛋白濃度。每孔上樣20μL，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓轉(zhuǎn)膜，30 V恒壓預(yù)跑15 min，80 V恒壓電泳跑至濃縮膠和分離膠分界線，120 V恒壓電泳90 min。再120 V恒壓轉(zhuǎn)膜90～120 min。50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（GRP78、CHOP、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β的一抗?jié)舛葹?:300，caspase-12和 GAPDH的一抗?jié)舛葹?:1 000）孵育，4 ℃過夜。Tris-吐溫20緩沖液洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（GRP78、CHOP的二抗?jié)舛葹?:1 000，caspase-12、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β和GAPDH的二抗?jié)舛葹?:2 000），室溫孵育1 h，洗滌后，暗室中加化學(xué)發(fā)光顯色液顯色，X線膠片曝光，常規(guī)方法顯影、定影。以GAPDH作為內(nèi)參，采用Quantity One灰度分析軟件分析條帶的灰度值，結(jié)果以目的蛋白GRP78、CHOP、caspase-12與GAPDH內(nèi)參比值表示，p-Akt、p-GSK3β蛋白含量用p-Akt/Akt，p-GSK3β/GSK3β表示。本實驗重復(fù)進行3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察各組肌肉形態(tài)學(xué)變化 光鏡下HE染色觀察受壓肌肉組織顯示：Con組肌纖維排列緊密，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，骨骼肌橫紋清晰，無明顯的炎性細胞浸潤（見圖2A），與Con組相比，隨著受壓周期的延長，受壓組肌肉組織逐步出現(xiàn)退化的病理變化。表現(xiàn)為肌纖維排列紊亂、水腫，肌間隙增寬并出現(xiàn)少量的碎片（見圖2B-C），間質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)炎癥細胞浸潤逐漸加重，肌纖維出現(xiàn)溶解、斷裂，壞死碎片，空泡變性，玻璃樣變性等病理改變（見圖2C-E）；恢復(fù)期1 d組發(fā)現(xiàn)在肌纖維溶解、斷裂，壞死區(qū)域有大量的炎性細胞聚集（見圖2F），隨后的炎性細胞逐漸減少，但還存在大量的肌纖維紊亂、斷裂，壞死碎片等病理變化（見圖2G-I）。

2.2 受壓肌肉組織中caspase-3蛋白在不同階段的 表達 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示：caspase-3免疫 陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，主要位于胞漿。caspase-3蛋白在Con組中呈弱表達，隨著時間延長，其蛋白表達逐漸增加，9c組表達顯著；恢復(fù)期1 d組表達達高峰，隨后表達開始下降，見圖3。

2.3 Western blotting法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達 檢測結(jié)果顯示：與Con組相比，蛋白GRP78、CHOP、caspase-12的表達表現(xiàn)為損傷后呈上升趨勢，GRP78在3c組出現(xiàn)第一次峰值（P＜0.05），恢復(fù)期1 d組表達顯著（P＜0.05），5 d組出現(xiàn)第二次峰值（P＜0.01），7 d組開始下降（P＜0.05），但仍高于Con組；CHOP在1c組表達顯著（P＜0.05），9c組出現(xiàn)第一次高峰（P＜0.01），恢復(fù)期1 d、3 d組表達下降（P＜0.05），5 d組表達又開始上升（P＜0.05），7 d組表達達高峰（P＜0.01）；caspase-12在6c組表達顯著（P＜0.05），9c組出現(xiàn)第一次峰值（P＜0.01），1 d、3 d組持續(xù)高表達（P＜0.05），之后略有下降（P＜0.05），但仍明顯高于Con組，見圖4。

圖2 不同組受壓肌肉組織的組織改變（HE，×200）

圖3 不同組受壓肌肉組織中的caspase-3的表達（IHC，×200）

圖4 不同組受壓肌肉組織中GRP78、CHOP、caspase-12的表達

2.4 Western blotting法檢測Akt、GSK3β蛋白及其磷酸化程度 檢測結(jié)果顯示：與Con組相比，受壓組和恢復(fù)組p-Akt蛋白表達呈先上升后下降的趨勢。1c組，p-Akt表達顯著（P＜0.01），9c組蛋白表達下降最為明顯（P＜0.001）；1 d組表達開始增加（P＜0.001），3 d組表達呈現(xiàn)第一次高峰（P＜0.001）；p-GSK3β蛋白表達呈先上升后下降的趨勢，在1c、3c組，表達開始升高（P＜0.05），6c組表達開始下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），9c組蛋白表達下降最為明顯（P＜0.05）；恢復(fù)組p-GSK3β蛋白表達呈先下降后上升趨勢，表現(xiàn)為與9c組相比，1 d組略有下降（P＜0.05），3 d組下降明顯（P＜0.01），5 d 組表達開始增加（P＜0.01），7 d組表達出現(xiàn)高峰，見圖5。

圖5 不同組受壓肌肉組織中總的Akt、GSK3β及其磷酸化的程度

3 討論

3.1 探索難免性壓瘡損傷的細胞信號通路，可為臨床預(yù)防和治療提供干預(yù)靶點 壓瘡的發(fā)生及發(fā)展的細胞分子機制仍不明確，給臨床預(yù)防和治療壓瘡帶來了很大的困難。因此，對壓瘡損傷的細胞信號通路進行研究，尋找治療的分子靶點，可為臨床防治壓瘡提供新思路、新方法。研究表明，細胞凋亡機制成為組織損傷和修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點之一，尤其在皮膚創(chuàng)傷與愈合，慢性潰瘍形成與愈合的研究領(lǐng)域得到了大量的驗證。研究發(fā)現(xiàn)，ERS誘發(fā)的凋亡是一種細胞凋亡新途徑。本研究通過觀察難免性壓瘡形成和修復(fù)過程中細胞凋亡因子caspase-3、GRP78、CHOP、caspase-12及其Akt、GSK-3β磷酸化程度，觀察PI3K/Akt信號通路及其下游分子GSK3β在難免性壓瘡損傷中的表達變化，探討細胞凋亡在難免性壓瘡形成過程中的潛在作用及其細胞發(fā)生凋亡的信號通路，以尋找干預(yù)壓瘡的分子靶點。

HE染色結(jié)果表明，隨著受壓周期的延長，由于缺血性損傷作用使受壓肌肉組織出現(xiàn)逐步退化病理變化。具體表現(xiàn)為，受壓肌肉組織炎癥細胞增多，肌間隙增寬，肌纖維出現(xiàn)水腫、溶解、斷裂、空泡化、玻璃樣改變現(xiàn)象，在恢復(fù)組，由于缺血、低氧條件的改善，受壓組織炎性細胞浸潤程度逐漸減輕，但肌纖維恢復(fù)速度較慢，仍然存在肌纖維斷裂、壞死片段等病理現(xiàn)象，與臧爽等[7]研究結(jié)果一致。

3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白在難免性壓瘡中的表達及作用 ERS介導(dǎo)的細胞存亡具有環(huán)境刺激依賴性，應(yīng)激的強度和持續(xù)時間決定了細胞是否能夠恢復(fù)和維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。適宜的ERS可誘導(dǎo)GRPs、鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）、蛋白質(zhì)折疊酶等物質(zhì)的表達上調(diào)，增強細胞耐受應(yīng)激刺激能力[8]，而持續(xù)嚴(yán)重的ERS則誘導(dǎo)CHOP、caspase-12等促凋亡因子的表達及活化，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號途徑，導(dǎo)致細胞凋亡和組織損傷[9]。

本研究實驗組GRP78、CHOP、caspase-12的表達與前期研究結(jié)果[10-11]趨勢一致，但其在恢復(fù)期變化情況卻不清楚。本實驗發(fā)現(xiàn)，免疫組織化學(xué)法檢測caspase-3表達呈上升趨勢，具體表現(xiàn)為9c組出現(xiàn)第一次高峰，恢復(fù)期1 d、3 d組出現(xiàn)持續(xù)高表達，隨后出現(xiàn)下降趨勢；恢復(fù)組GRP78、CHOP、caspase-12 表達整體上呈上升趨勢，具體表現(xiàn)為1 d組GRP78表達顯著，CHOP蛋白表達下降，筆者認(rèn)為，可能與損傷后恢復(fù)期間，由于損傷后早期的再灌注損傷，產(chǎn)生大量的自由基，使機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而誘導(dǎo)ERS持續(xù)存在，起細胞保護作用的GRP78高表達可以處理機體的錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白，使ER內(nèi)穩(wěn)態(tài)恢復(fù)平衡；5 d組GRP78出現(xiàn)第二次峰值， 7 d組出現(xiàn)下降趨勢，而CHOP蛋白在5 d組表達下降，7 d組表達出現(xiàn)第二次峰值，筆者認(rèn)為可能與自由基的連鎖反應(yīng)使機體持續(xù)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致ER腔積聚過多的錯誤折疊蛋白，超過機體的處理能力，激活下游CHOP蛋白表達，處理過度受損的細胞，這與左群等[12]研究結(jié)果趨勢一致；而恢復(fù)組caspase-12在1 d、3 d組持續(xù)高表達，之后出現(xiàn)下降趨勢，前期出現(xiàn)持續(xù)高表達，可能與其特有的通路有關(guān)，后期出現(xiàn)下降趨勢，這與免疫組織化學(xué)caspase-3的表達趨勢一致。

3.3 PI3K/Akt/GSK3β信號通路對細胞的調(diào)節(jié)作用是否與難免性壓瘡損傷存在聯(lián)系 近年來，越來越多的研究[3]報道，肌肉損傷恢復(fù)情況與肌細胞凋亡存在密切的關(guān)系，但具體的細胞凋亡信號通路仍不清楚。研究表明，PI3K/Akt、GSK-3β通路是調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡和衰老的關(guān)鍵途徑[4]。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它是PI3K下游最重要的效應(yīng)遞質(zhì)，能調(diào)節(jié)各種細胞內(nèi)的信號通路?；罨腁kt磷酸化后，進一步激活或抑制其下游的靶蛋白，進而發(fā)揮其調(diào)節(jié)細胞增殖、分化，葡萄糖代謝以及遷移等作用。當(dāng)組織細胞遭受缺血-再灌注損傷時，活化的Akt還可以防止細胞凋亡，促進細胞的存活[13]。

GSK3β是Akt下游的一種活性激酶，主要是通過抑制其活性來調(diào)節(jié)其功能的。GSK3β不僅能調(diào)節(jié)糖代謝，而且在細胞增殖、生長及死亡中也發(fā)揮了重要作用。當(dāng)組織面臨缺血性損傷和再灌注損傷時，GSK3β活化會促進caspase-3的激活和細胞色素c的釋放，促進細胞程序性死亡，加重損傷。

本研究Western blotting法檢測發(fā)現(xiàn)，隨著受壓周期次數(shù)的延長，p-Akt蛋白表達呈逐漸下降的趨勢，p-GSK3β蛋白表達呈先上升后下降的趨勢，恢復(fù)組p-Akt蛋白表達呈上升趨勢，p-GSK3β蛋白表達呈先下降后上升趨勢。筆者推測，由于外面施加的機械性壓力，激活了PI3/Akt信號通路，致使1c組，p-Akt表達出現(xiàn)第一次高峰，隨著受壓周期次數(shù)的增加，缺血再灌注損傷加重，抑制了Akt活性，使Akt磷酸化程度下降；9c組Akt磷酸化程度下降最為明顯，細胞凋亡最為明顯，與CHOP、caspase-12、caspase-3的表達成反比；Akt活性被抑制，從而抑制了GSK3β的ser9位點進行磷酸化，表現(xiàn)為p-GSK3β呈下降的趨勢，促進了MPTP開放，促進細胞凋亡；恢復(fù)組由于解除了外部機械性壓力和缺血性損傷的改善，逐漸恢復(fù)了Akt的活性，但仍然不能明顯改善細胞凋亡的命運，這與Mozaffari等[14]的研究結(jié)果一致。

總之，難免性壓瘡之所以難以恢復(fù)可能與PI3K/Akt/GSK3β信號通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)，這將為我們接下來的干預(yù)實驗提供理論依據(jù)。