黃一偉，張懷勤，林斌，王軍，毛義建

近年來，隨著人民生活水平的提高，我國(guó)冠心病的發(fā)病率和病死率也逐年提高，并呈年輕化趨勢(shì)。冠心病目前被認(rèn)為是一種由各種高危因素（疾?。┖投鄠€(gè)遺傳因素共同作用而發(fā)病的多基因遺傳性疾病，其中內(nèi)皮功能障礙與冠心病的發(fā)病、進(jìn)展密切相關(guān)[1]?？扇苄原h(huán)氧化物水解酶（EPHX2）是通過水解體內(nèi)的環(huán)氧二十碳烯酸（EETs）來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能[2]。近年來多項(xiàng)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)EPHX2基因位點(diǎn)的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）與多種心血管疾病存在相關(guān)性[3-5]，其中rs751141 G/A多態(tài)性與原發(fā)性高血壓病、冠心病的關(guān)系之前已有報(bào)道[6]。本研究通過對(duì)176例冠心病患者與179例經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈造影（CAG）顯示正常者EPHX2基因rs2271001 A/G位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，探討其與中國(guó)浙江籍漢族人群冠心病的相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2010年8月至2013年3月在我院心血管內(nèi)科住院的患者共355例，入選對(duì)象均為浙江籍漢族且無(wú)親緣關(guān)系，排除惡性腫瘤、外周血管病、腦血管病。記錄患者的年齡、性別、家族史、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）等基本資料和冠心病危險(xiǎn)因素如有無(wú)吸煙史、血漿總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平。所有患者均經(jīng)CAG檢查，以冠狀動(dòng)脈任何一支血管直徑狹窄程度≥50%為陽(yáng)性。根據(jù)造影結(jié)果分為2組：冠心病組，CAG結(jié)果陽(yáng)性，共176例，男135例，女41例，年齡44～88歲，平均（64.12±10.22）歲；對(duì)照組，CAG結(jié)果陰性，共179例，男118例，女61例，年齡32～84歲，平均（60.01±11.50）歲。冠心病組與對(duì)照組臨床資料比較見表1。

表1 冠心病組與對(duì)照組臨床資料比較（ ±s）

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提?。撼槿〖s5 mL空腹靜脈血，使用1×RBC裂解液、1×細(xì)胞核裂解液、20%十二烷基磺酸鈉（SDS）、蛋白酶K、Tris飽和酚、氯仿、無(wú)水乙醇、70%乙醇、TE緩沖液等，通過常規(guī)酚/氯仿抽提法提取所有患者外周血白細(xì)胞DNA，稀釋DNA樣本并用紫外可見分光光度儀檢測(cè)樣本濃度，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 基因位點(diǎn)檢測(cè)方法：設(shè)計(jì)上游引物：5’-GCTT CTTCATTGGGCTGCTA-3’，下游引物：5’-TGAGACTTCC CATTCTCTTCTGA-3’（購(gòu)自上海生工生物工程有限公司）。PCR擴(kuò)增體系：總反應(yīng)體積20μL，終濃度為10 ng/μL的基因組DNA 1μL，終濃度為4μM/μL的上、下游引物各1μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性 2 min后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 5 min、 95 ℃ 50 s、60 ℃ 50 s，共40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后 設(shè)置4 ℃保溫。將PCR管置于ABI 2720 PCR儀上進(jìn)行 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物應(yīng)用Sanger法進(jìn)行測(cè)序，反應(yīng)體系為：總反應(yīng)體積5μL，PCR純化產(chǎn)物1μL，Bigdye3.1 （終止子循環(huán)測(cè)序反應(yīng)染料，購(gòu)自ABI公司）1μL，測(cè)序分型試劑盒提供的測(cè)序引物1μL（購(gòu)自上海生工生物工程有限公司），反應(yīng)條件為：98 ℃變性2 min 后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96 ℃ 10 s、50 ℃ 50 s、60 ℃ 4 min，共25個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4 ℃保溫。測(cè)序PCR反應(yīng)產(chǎn)物采用醋酸鈉/乙醇法純化，純化產(chǎn)物在ABI 3100遺傳分析儀上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用CHROMAS軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用±s表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；基因型和等位基因頻率采用頻率計(jì)數(shù)法計(jì)算；基因型資料采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)；單個(gè)基因型及組間等位基因頻率比較采用x2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPHX2基因rs2271001 A/G多態(tài)性分析 選取各種不同基因型PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見AA、AG、GG 3種基因型分布（見圖1）。冠心病組與對(duì)照組的EPXH2基因rs2271001位點(diǎn)基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，冠心病組與對(duì)照組基因型的觀察數(shù)與期望數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。說明本研究人群對(duì)rs2271001 A/G位點(diǎn)有較好的群體代表性。

圖1 EPHX2基因rs2271001 A/G測(cè)序結(jié)果

表2 EPHX2基因rs2271001 A/G基因型頻率及遺傳平衡吻合度檢驗(yàn) n（%）

2.2 等位基因與基因型頻率分布 冠心病組和對(duì)照組EPHX2基因rs2271001 A/G多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組中GG、AG和AA基因型頻率分別為5.59%、7.82%和86.59%，G、A等位基因頻率分別為9.50%、90.50%。而在冠心病組中GG、AG和AA基因型頻率分別為12.50%、11.93%和75.57%，G、A等位基因頻率分別為18.47%、81.53%。2組間基因型頻率分布和等位基因G、A的頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 2組EPHX2基因rs2271001位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布 n（%）

3 討論

EPHX2和細(xì)胞色素P450 2C9共同集中分布于人體許多組織中，細(xì)胞色素P450 2C9是將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為環(huán)氧二十碳三烯酸（EETs）的主要亞型，而EETs在抗血小板、抗炎、舒張血管、抑制血管平滑肌細(xì)胞移形、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和胰島素抵抗等方面具有重要的作用[7-9]。EETs主要經(jīng)EPHX2水解成二羥基衍生物而失去生物學(xué)活性。故EPHX2通過水解EETs達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞和EETs活性的作用。EPHX2由兩個(gè)富含不同羥脯氨酸多肽結(jié)構(gòu)域組成的同型二聚體[10]， 每個(gè)單體的兩個(gè)多肽結(jié)構(gòu)區(qū)域均能選擇性地催化、水解環(huán)氧化物，C-末端區(qū)域含有典型的α/β-水解酶折疊結(jié)構(gòu)，具有環(huán)氧化物水解酶活性；N-末端區(qū)域具有脂質(zhì)磷酸酶活性，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究及流行病學(xué)研究表明，其在降膽固醇、抗炎、預(yù)防心血管疾病以及穩(wěn)定EPHX2活性方面發(fā)揮重要作用[11-12]。近幾年來，越來越多的EPHX2抑制劑被用于冠心病患者。許丹焰等[13]發(fā)現(xiàn)使用EPHX2抑制劑可促進(jìn)冠心病患者新生血管的形成和損傷內(nèi)皮的修復(fù)，作用機(jī)制可能是通過加強(qiáng)血管通透性因子的活性，正向調(diào)節(jié)成血管細(xì)胞，參與內(nèi)皮修復(fù)和血管再生。EPHX2抑制劑可能為今后冠心病的防治提供新思路，其具體機(jī)制及遠(yuǎn)期療效有待進(jìn)一步研究。

人類EPHX2具有多態(tài)性，包括5c側(cè)翼區(qū)的插入/缺失多態(tài)構(gòu)象，不同的基因類型表達(dá)不同的EPHX2活性產(chǎn)物。近年來多項(xiàng)EPHX2多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，EPHX2的活性跟R287Q及K55R突變相關(guān)[3，6]；美國(guó)的社區(qū)動(dòng)脈粥樣硬化研究也發(fā)現(xiàn)高加索人種冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與EPHX2基因rs2271001位點(diǎn)多態(tài)性存在相關(guān)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)在中國(guó)浙江籍漢族人群中，冠心病組和對(duì)照組rs2271001位點(diǎn)基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且冠心病組G與A等位基因的頻率分布與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），G等位基因頻率（為18.47%）明顯高于對(duì)照組（為9.50%），提示rs2271001位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病的發(fā)病率相關(guān)，G等位基因可能是中國(guó)浙江籍漢族人群冠心病發(fā)病的易感因素之一。此外，我們?cè)谖鼰熁颊咧邪l(fā)現(xiàn)rs2271001位點(diǎn)變異更為多見，這與吸煙導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙、為冠心病重要的危險(xiǎn)因素之一相符合，但是兩者是否存在相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。