張相國(guó) 李警鋒 何宗師 徐 達(dá) 黃 偉 廖衛(wèi)堅(jiān)

鼻咽癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與其預(yù)后相關(guān)性的臨床研究

張相國(guó) 李警鋒 何宗師 徐 達(dá) 黃 偉 廖衛(wèi)堅(jiān)

目的 探討鼻咽癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)意義及其與預(yù)后的關(guān)系。方法 隨機(jī)抽取經(jīng)病理檢查確診的鼻咽癌初治病例98例。取鼻咽癌組織和口腔脫落細(xì)胞，Chelex-100法提起DNA，用PCR方法對(duì)15個(gè)染色體基因(D8S1179、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、D21S11、D7S820、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離和激光掃描分析，STR基因座檢測(cè)，基因分型，確定是否存在變異。結(jié)果 98例鼻咽癌石蠟組織與口腔脫落細(xì)胞基因型分析對(duì)比，8例表現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，占8.16%，7例為單個(gè)位點(diǎn)變異，1例為兩個(gè)基因位點(diǎn)變異。其中D18S51出現(xiàn)MSI共3例，D16S539出現(xiàn)MSI共6例。Ⅱ～Ⅳ期患者均有MSI發(fā)生，Ⅱ期2例，Ⅲ期2例，Ⅳ期4例。鼻咽癌MSI與患者年齡、性別、T分級(jí)、TNM分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、顱底侵犯、病理類型等均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)；用McNemar檢驗(yàn)比較兩類變異位點(diǎn)情況，P>0.05為無(wú)顯著相關(guān)性；生存曲線提示鼻咽癌MSI患者較未發(fā)生MSI患者預(yù)后好。但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 鼻咽癌存在MSI現(xiàn)象，MSI可能是其預(yù)后的重要生物學(xué)因素，MSI可為鼻咽癌個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

鼻咽腫瘤；微衛(wèi)星不穩(wěn)定性；意義；預(yù)后

(ThePracticalJournalofCancer，2014，29：1522～1525)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)南方常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，又叫“廣東瘤”，侵襲力強(qiáng)且易早期發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，侵襲和轉(zhuǎn)移是其獨(dú)立預(yù)后因素。鼻咽癌已成為威脅生命安全的主要疾病之一。目前腫瘤研究已經(jīng)進(jìn)入了基因水平，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、分期、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移多與患者基因表達(dá)相關(guān)[1]。近10余年來(lái)，對(duì)于MSI的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)日趨成熟，從而使我們可以進(jìn)一步了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展?，F(xiàn)代腫瘤學(xué)說(shuō)認(rèn)為，癌癥是在分子水平至少出現(xiàn)多次遺傳學(xué)變化。遺傳不穩(wěn)定性是引起這些變化的可能機(jī)制。因此，研究鼻咽癌基因變異對(duì)于進(jìn)一步了解鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有積極意義，同時(shí)也是預(yù)防和治療該病的基礎(chǔ)，具有重要的臨床意義。本研究對(duì)98例患者鼻咽癌蠟塊組織和口腔脫落細(xì)胞基因座分型對(duì)比分析微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2011年3月至2013年5月經(jīng)確診并行3D-CRT或IMRT放療的鼻咽癌患者98例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡22～75歲且PS評(píng)分≤2分。②按照鼻咽癌(2008廣州分期)分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期；③經(jīng)病理檢查確診為鼻咽癌，且尚未進(jìn)行任何抗癌治療(放化療)的初治者；④行鼻咽+顱底MR平掃+增強(qiáng)檢查證實(shí)具有可測(cè)量的腫瘤病灶；⑤均有保存完好的鼻咽癌石蠟病理標(biāo)本，取入組患者口腔脫落細(xì)胞作為基因分型正常對(duì)照。⑥無(wú)明顯放化療禁忌者及并發(fā)癥。從患者出院后開(kāi)始定期隨訪，隨訪日期截至2014年9月，98例患者中11例失訪。

1.2 DNA提取

1.2.1 鼻咽癌石蠟組織的DNA提取 經(jīng)過(guò)病理檢查確診的組織蠟塊，事先將腫瘤區(qū)域標(biāo)示出來(lái)，每個(gè)樣本以約(4.0～5.0)cm2×5.0 μm的組織量為宜，使用一次性解剖刀從組織片中刮取石蠟組織至離心管中，盡量避免碎片組織飛散造成交叉污染，使DNA從細(xì)胞核中釋放，蛋白酶K消化組蛋白，消化裂解過(guò)夜，過(guò)程中至少重復(fù)加入10 mg/mL蛋白酶K 4 μL兩次，其中每次時(shí)間間隔1小時(shí)以上。通過(guò)離心，石蠟將懸浮于裂解液上層，吸取石蠟層下的溶液，注意在吸取時(shí)應(yīng)盡量避免吸入石蠟等污染物，用Qiagen吸附柱收，將DNA置于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 口腔脫落黏膜細(xì)胞中的DNA提取 用無(wú)菌棉簽刮拭口腔黏膜3～4次，將其放入1.5 ml無(wú)菌離心管內(nèi)，加入1 ml雙蒸水，反復(fù)擠壓攪伴，目的使細(xì)胞脫落，10 000 r/min離心3 min，倒掉上清液，沉淀物加入TE緩沖液100 μl，隨后高速振蕩5～10 s，懸浮沉淀，沸水再煮10 min后冰浴3～5 min，高速振蕩5～10 s，10 000 r/min離心3 min，然后取上清液用于擴(kuò)增反應(yīng)，4℃保存或-20°C凍存剩余DNA。

1.3 DNA分析

將提取的DNA樣本用ABI Identifier試劑盒對(duì)15個(gè)染色體基因(D8S1179、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、D21S11、D7S820、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μl。擴(kuò)增體系包括：混合物(Reaction Mix)為10 μl，引物(Primer Set)為5 μl，DNA樣本9.5 μl，Tap聚合酶( DNA Polymerase)為0.5 μl，擴(kuò)增循環(huán)28次，擴(kuò)增結(jié)束后取擴(kuò)增后的產(chǎn)物2 μl，用3130XL遺傳分析儀檢測(cè)，得到各個(gè)樣本的STR分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。變異位點(diǎn)與年齡、性別、T分級(jí)、TNM分期、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、顱底侵犯、病理類型等的比較用χ2檢驗(yàn)，用Kaplan—Meier法繪制生存曲線，并以Log-rank法進(jìn)行檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌石蠟組織與口腔脫落細(xì)胞基因分析對(duì)比

98例鼻咽癌石蠟組織與口腔脫落細(xì)胞基因分析對(duì)比，8例表現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，占8.16%，7例為單個(gè)位點(diǎn)變異，1例為兩個(gè)基因位點(diǎn)變異。其中D18S51出現(xiàn)MSI共3例，D16S539出現(xiàn)MSI共6例。Ⅱ～Ⅳ期都有MSI發(fā)生，Ⅱ期2例，Ⅲ期2例，Ⅳ期4例。

2.2 基因座D16S539及D18S51與其臨床特征的關(guān)系

鼻咽癌MSI患者基因座D16S539及D18S51與患者年齡、性別、T分級(jí)、TNM分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、顱底侵犯、病理類型等均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)；見(jiàn)表1。

2.3 兩類變異位點(diǎn)出現(xiàn)情況比較

D16S539 、D18S51兩類變異位點(diǎn)出現(xiàn)情況比較采用McNemar檢驗(yàn)，P>0.05，結(jié)果示無(wú)顯著相關(guān)性，見(jiàn)表2。

2.4 兩組生存曲線比較

兩組生存曲線隨著生存時(shí)間的延長(zhǎng)，生存曲線從1.0～0逐漸呈階梯狀下降；生存曲線表明鼻咽癌MSI組生存率稍高于未發(fā)生MSI組，提示鼻咽癌MSI患者較未發(fā)生MSI患者預(yù)后好，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

表1 基因座D16S539及D18S51與鼻咽癌臨床特征的關(guān)系/例

表2 兩類變異位點(diǎn)出現(xiàn)情況比較/例

注：χ2=0.571，P=0.453。

圖1 基因變異組與基因未變異組患者的生存曲線比較

3 討論

微衛(wèi)星是一類高度多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，由2～6個(gè)核苷酸組成的具有高度多態(tài)性的簡(jiǎn)單串聯(lián)排列的DNA序列。MSI是指腫瘤組織與其相應(yīng)非腫瘤組織相比，其結(jié)構(gòu)性等位基因的大小發(fā)生改變，即微衛(wèi)星重復(fù)單元的增加和丟失。當(dāng)有無(wú)位點(diǎn)不穩(wěn)定時(shí)判定為腫瘤微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability，MSS)；出現(xiàn)1個(gè)位點(diǎn)不穩(wěn)定為低頻率MSI( low-frequent MSI，MSI-L)；≥2 個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)不穩(wěn)定，為高M(jìn)SI( high-frequent MSI，MSI-H)[2]。遺傳不穩(wěn)定性是實(shí)體瘤的常見(jiàn)表現(xiàn)[3]。已經(jīng)有很多腫瘤被證明與MSI有關(guān)，如原發(fā)性食管癌和原發(fā)性頭頸部腫瘤、肺癌、男性泌尿系統(tǒng)腫瘤、女性生殖系統(tǒng)腫瘤、兒童胚胎性腫瘤等[4-5]。在MSI-H腫瘤中，對(duì)MSI發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展。大量研究發(fā)現(xiàn)，MSI在肺癌、食管癌、膀胱癌早期診斷方面具有很高的特異性，并且伴有MSI的結(jié)直腸癌及食管癌病人預(yù)后好于不伴有MSI的患者。MSI首先是在遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌中被發(fā)現(xiàn)的，以后在各種散發(fā)性腫瘤中發(fā)現(xiàn)MSI現(xiàn)象。結(jié)直腸癌目前在國(guó)內(nèi)外發(fā)病率均逐漸升高，成為危害人類生命的重要疾病，且遺傳傾向明顯，是目前人類惡性腫瘤中遺傳變化最明顯的腫瘤。近年研究發(fā)現(xiàn)MSI與結(jié)直腸癌發(fā)病密切相關(guān)，并與結(jié)直腸癌患者臨床病理特點(diǎn)及預(yù)后相關(guān)。他們認(rèn)為約15%的大腸癌存在這種突變，這種基因的不穩(wěn)定性與DNA 錯(cuò)配修復(fù)基因功能缺陷有密切的關(guān)系。MSI的結(jié)直腸患者具有獨(dú)特的臨床病理特征，如低分化、黏液腺癌等[6-7]。近年來(lái)有學(xué)者提出[8-9]MSI及其他分子標(biāo)記物可預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者化療敏感性，同時(shí)也可成為判斷預(yù)后的指標(biāo)，可為個(gè)體化治療提供理論依據(jù)，但目前尚需大樣本的前瞻性臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。鄢踐等認(rèn)為[10]幾乎所有實(shí)體瘤都存在遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象。該研究用染色體l6g22-24 上的8對(duì)微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記分析50例鼻咽癌的MSI與雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)。結(jié)果：至少一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生MSI的發(fā)生率為18%(9/50)，LOH的腫瘤占48%(24/50 )。這些變化僅散在性分布，其變化在早期(Ⅰ、Ⅱ期)和晚期(Ⅲ、Ⅳ期)患者之間有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：鼻咽癌的染色體l6g22-24 區(qū)存在遺傳不穩(wěn)定性，它可能對(duì)鼻咽癌發(fā)病有一定影響。大量研究已證實(shí)散發(fā)性實(shí)體癌中的MSI現(xiàn)象，但對(duì)其在腫瘤癌變過(guò)程中的意義及其產(chǎn)生機(jī)制并不了解。有人認(rèn)為MSI是基因組不穩(wěn)性的一種類型，正是這種不穩(wěn)定性使細(xì)胞易于轉(zhuǎn)化的遺傳學(xué)改變。也有人認(rèn)為癌癥是1種增變子表型(mutator phenotype)，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是增變子表型的標(biāo)志。目前MSI的產(chǎn)生及腫瘤的關(guān)系得到廣泛地研究，但仍存在許多需要解決的問(wèn)題[2]。

目前研究鼻咽癌在MSI方面的研究并不常見(jiàn)。本研究98例鼻咽癌石蠟組織與口腔脫落細(xì)胞基因分析對(duì)比，8例表現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，占8.16%。7例為單個(gè)位點(diǎn)變異，1例為2個(gè)基因位點(diǎn)變異。其中D18S51出現(xiàn)MSI共3例，D16S539出現(xiàn)MSI共6例。Ⅱ～Ⅳ期都有MSI發(fā)生，Ⅱ期2例，Ⅲ期2例，Ⅳ期4例。鼻咽癌MSI患者與年齡、性別、T分級(jí)、TNM分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、顱底侵犯、病理類型等均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)；用McNemar檢驗(yàn)比較兩類變異位點(diǎn)情況，P>0.05，無(wú)顯著相關(guān)性；生存曲線提示鼻咽癌MSI患者較未發(fā)生MSI患者預(yù)后好。但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與文獻(xiàn)報(bào)道的多種常見(jiàn)散發(fā)性癌癥的MSI的大致相似。

綜上所述，鼻咽癌MSI者可能有較好的預(yù)后趨勢(shì)。但本研究結(jié)果畢竟是陰性，分析不足之處①人類正?；蚪M至少攜帶10 萬(wàn)個(gè)微衛(wèi)星，約有1.5萬(wàn)個(gè)標(biāo)志物包含人所有染色體，MSI可能出現(xiàn)在多個(gè)基因片段。本研究標(biāo)記的微衛(wèi)星位點(diǎn)少，且病例不多，其中失訪了11例，可能還不能使結(jié)果達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的最小樣本量。②STR基因變異檢測(cè)過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化及結(jié)果的觀察與對(duì)比的準(zhǔn)確性，使研究結(jié)果存在一定的偏倚。因此，鼻咽癌存在MSI現(xiàn)象，MSI可能是預(yù)后的重要生物學(xué)因素，MSI可為鼻咽癌個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。MSI對(duì)鼻咽癌預(yù)后的影響仍有待進(jìn)一步深入研究。

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(編輯：吳小紅)

Clinical Study of Significance of Nasopharyngeal Carcinoma Microsatellite Instability and Its Relationship with Prognosis

ZHANGXiangguo，LIJingfeng，HEZongshi，etal.

YuebeiPeople'sHospitalAffiliatedtoShantouUniversity，Shaoguan，512026

Objective To explore the significance of nasopharyngeal carcinoma microsatellite instability ( MSI) and its relationship with prognosis.Methods 98 cases of nasopharyngeal carcinoma confirmed by pathological diagnosis

initial treatment.Nasopharyngeal carcinoma tissues and exfoliated cells in oral were colleced.Chelex - 100 method was used to extract DNA，and polymerase chain reaction (PCR) was used to amplificate 15 chromosome gene (D8S1179，CSF1PO，D3S1358，TH01，D13S317，D16S539，D2S1338 and D19S433，D21S11，D7S820，VWA，TPOX，D18S51，D5S818，F(xiàn)GA).Amplification product received electrophoresis separation，laser scanning，STR loci detection，and genotyping，determine whether there was variation.Results 98 cases of nasopharyngeal carcinoma paraffin tissues and oral exfoliated cells underwent genotype analysis，8 cases showed microsatellite instability，accounting for 8.16%.7 cases had a single locus mutation，1 case had 2 gene loci mutation.D18S51 had MSI in 3 cases，D16S539 had MSI in 6 cases.Ⅱ～Ⅳ period all has MSI，Ⅱ period had 2 cases，Ⅲ period had 2 cases，and Ⅳ period had 4 cases.Nasopharyngeal carcinoma MSI had no relation with age，sex，T stage，TNM staging，neck lymph node metastasis，skull base invasion and pathological types (P> 0.05)；McNemar test was used to compare 2 kinds of mutation sites，P> 0.05，there had no significant correlation；Survival curve showed that nasopharyngeal carcinoma with MSI had better prognosis than that without MSI，there was no statistically significant difference (P> 0.05).Conclusion MSI exists in nasopharyngeal carcinoma，and MSI may be an important biological prognostic factor.MSI can provide theoretical basis for individualized treatment of nasopharyngeal carcinoma.

Nasopharyngeal cancer；Microsatellite instability；Significance；Prognosis

廣東省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目(編號(hào)：A2012687)；韶關(guān)市醫(yī)藥衛(wèi)生科研計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：Y12154)；韶關(guān)市科技局科研項(xiàng)目(編號(hào)：2012CX/K54)

512026 汕頭大學(xué)附屬粵北人民醫(yī)院放療科(張相國(guó)，黃偉，廖衛(wèi)堅(jiān))；512000 韶關(guān)市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所(李警鋒，何宗師，徐 達(dá))

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.004

R739.63

A

1001-5930(2014)12-1522-04

2014-09-21

2014-10-30)