高 巖 姜 浩 孫治國 高 健

EP4在結(jié)腸癌細胞株HT29增殖中的作用

高 巖 姜 浩 孫治國 高 健

目的 探討PGE2誘導結(jié)腸癌細胞株HT29增殖和凋亡的機制，明確以EP4為靶點治療結(jié)腸癌的作用途徑。方法 將EP4抑制劑L161982按不同濃度作用于結(jié)腸癌細胞系HT29，用MTT(四甲基偶氮唑藍比色法)法分別于作用12、24、48、72 h時檢測細胞增殖狀態(tài)；流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，進一步采用Western Blot法檢測Caspase-3的表達。結(jié)果 EP4抑制劑L161982對結(jié)腸癌細胞系HT29呈時間、劑量依賴性方式抑制細胞增殖；流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，隨著L161982劑量增加，HT29細胞凋亡增強；凋亡蛋白Caspase-3表達水平隨L161982劑量增加而升高。結(jié)論 PGE2可能通過EP4受體作用于結(jié)腸癌細胞，通過Caspase-3途徑影響結(jié)腸癌細胞HT29的增殖與凋亡，這可能是結(jié)腸癌細胞增殖的分子機制。

前列腺素E2；前列腺素E受體4；HT29

(ThePracticalJournalofCancer,2014,29:1518～1521)

4種受體中EP4在人結(jié)腸癌細胞HT29存在量最大，EP4 通過與刺激型 G 蛋白(Gs)結(jié)合激活腺苷酸環(huán)化酶，并且提高細胞內(nèi)cAMP的水平，能夠調(diào)節(jié)細胞周期及增殖，抑制EP4能夠降低結(jié)腸腫瘤細胞的增殖[4]，但具體作用機制尚不明確。有研究表明，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中PGE2途徑失調(diào)誘發(fā)多種致癌信號，從而促進癌變[5]。越來越多的證據(jù)表明，PGE2及其受體是惡性腫瘤病理生理過程中的一個重要環(huán)節(jié)，在結(jié)腸癌的進展過程中起重要作用，對它的作用機制的研究及相關(guān)藥物的開發(fā)將是相關(guān)領域的一個新熱點。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人結(jié)腸癌細胞株 HT29(牡丹江醫(yī)學院傳代培養(yǎng))，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，流式檢測凋亡試劑盒AnnexinV-FITC Apoptosis Detection Kit I(BD 上?；蚬?，Caspase-3 兔抗人多克隆抗體、β-actin兔抗人多克隆抗體(SANTA上海中杉公司)、Fas兔抗人多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠二抗IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、辣根過氧化物酶 (HRP)標記山羊抗兔二抗IgG，EP4抑制劑L161982(Cayman Chemical)。細胞培養(yǎng)所用儀器及Western blot 所使用試劑及儀器均為牡丹江醫(yī)學院提供。

1.2 實驗分組

分為 5組：正常對照組(Control組)，常規(guī)方法培養(yǎng)；L161982不同劑量組 (Ll、L2、L3、L4組)：加入L161982于 DMEM 培養(yǎng)基，使其終濃度分別為10、30、60、120 μM，常規(guī)方法培養(yǎng)。

1.3 試驗方法

1.3.1 結(jié)腸癌細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌HT29細胞，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，接種至細胞培養(yǎng)瓶后，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天更換細胞培養(yǎng)液1次，每培養(yǎng)3～5 d傳代 1次；取對數(shù)生長期細胞用于實驗[6]。

1.3.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率 選取處于對數(shù)生長期的HT29細胞，經(jīng)過處理制成混懸液后接種于96孔板內(nèi)，每孔均加入細胞懸液 200 μL，細胞最佳接種密度為 2.5×10/L，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h顯微鏡觀察細胞貼壁，吸去原培養(yǎng)液后按不同組別處理加入培養(yǎng)基(每孔200 μL)；以 DMEM 培養(yǎng)液作為空白對照孔，以含 0.1% 二甲基亞砜(DMSO)培養(yǎng)基作為陰性對照。取分別處理培養(yǎng)第12、24、48、72 h為檢測點。于檢測點時間每孔加入無菌MTT溶液20 μL，繼續(xù)在原條件下CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液后每孔再加入150 μL DMSO，振蕩 10 min，在酶標儀上測出各孔的A值。抑制率=(陰性對照組 A 值-實驗組 A 值)/陰性對照組A值×100%。

通過政策的支持，河北省特色農(nóng)產(chǎn)品先后通過淘寶、京東等電商企業(yè)平臺，將農(nóng)產(chǎn)品進行銷售，帶動河北省特色農(nóng)產(chǎn)品行業(yè)發(fā)展，提升其品牌知名度。

1.3.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 參照Annexin V 細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。細胞不同分組處理培養(yǎng)48 h后，每組收集1×106個細胞,冷PBS 洗滌 2 次,1 000 r/ min 離心,棄上清。將細胞重懸于1 mL 1×binding buffer,取100 μL 細胞置于流式細胞儀專用試管中,加5 μL AnnexinV FITC 和10 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min，加入300 μL 1×binding buffer，應用流式細胞儀進行檢測分析，CellQuest軟件分析結(jié)果。

1.3.4 采用 Western Blot法檢測細胞中Caspase-3蛋白的表達 HT29細胞,經(jīng)不同分組處理后,提取總蛋白,測定總蛋白質(zhì)濃度。等量蛋白質(zhì)進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳,轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至硝酸纖維素膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,用鼠多克隆抗Caspase-3抗體在5%的脫脂奶粉中4 ℃過夜。二抗為辣根過氧化物酶標記的抗鼠抗體，室溫1 h,最后用增強化學發(fā)光(ECL)自顯影顯像在膠片上,膜用洗脫液洗脫后檢測β-actin的表達。應用Gel-pro Analyzer 4.0圖像分析軟件，測得目的蛋白條帶積分光密度值，以各組β-actin條帶的積分光密度值對Caspase-3蛋白表達量進行標化。

1.4 統(tǒng)計處理

所有影像用Scion Image 軟件量化處理，統(tǒng)計學分析應用Statview軟件的單因素方差分析(One-wayANOVA)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間點HT29細胞的增殖抑制率(MTT比色測定法)

2.1.1 不同劑量組同一時間點比較 與對照組比較，各劑量組細胞的增殖抑制率在藥物干預第 12、24、48、72 h時間點均顯著升高，有顯著性差異 (P<0.05)；L2、3、4組與前一組比較，細胞增殖抑制率有顯著性差異 (P>0.05)，見圖1。結(jié)果表明抑制EP4能夠抑制人結(jié)腸癌細胞 HT29的生長增殖，且抑制率隨著抑制劑劑量增大而升高，呈現(xiàn)顯著的劑量相關(guān)性。

2.1.2 同一劑量組不同時間點比較 與對照組相比，除 Ll組外其余3組抑制率均有不同程度增高，差異具有統(tǒng)計學意義；L2、3、4組作用24 h的抑制率明顯增高，與12 h時間點比較差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)；其后隨著時間延長，細胞增殖抑制率進一步升高，見圖1。結(jié)果表明L161982的增殖抑制作用隨著作用時間的延長而增強，存在較明顯的時間依賴關(guān)系。

圖1 MTT比色法測定HT29細胞的增殖抑制率

2.2 各組HT29細胞凋亡率

L2、3、4劑量組培養(yǎng)第24h檢測細胞凋亡率,contro1組HT29細胞極少發(fā)生凋亡,L2、3、4組細胞凋亡率明顯增高，與 control組比較存在顯著差異(P<0.05，n=3)，L4組凋亡最明顯,見圖2。

2.3 Caspase-3蛋白的表達

Caspase-3在contro1組HT29細胞中表達水平較低；L161982各劑量組Caspase-3表達水平均明顯上調(diào)，與對照組比較有顯著統(tǒng)計學差異 (P<0.05，n=3),其中L4組的表達水平最高，提示L161982可有效增加Caspase-3蛋白表達，見圖3。

圖2 流式細胞技術(shù)檢測HT29細胞凋亡情況

圖3 L161982對HT29細胞Caspase-3表達的影響

3 討論

研究表明，PGE2及其受體是惡性腫瘤增殖轉(zhuǎn)移過程中的一個重要環(huán)節(jié)[7-8]，最新研究中有科學家表明EP4受體在腫瘤的病理過程中發(fā)揮重要作用[9-11]。本實驗探討了EP4受體在人結(jié)腸癌細胞HT29中的作用，對PGE2 受體的研究將為治療結(jié)腸癌更加特異的治療靶點。

細胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及抗腫瘤藥物的治療中起著重要作用，細胞凋亡啟動和執(zhí)行的發(fā)生過程受到精確調(diào)控，存在于細胞漿中的Caspases家族蛋白啟動和執(zhí)行凋亡過程中起到關(guān)鍵作用，細胞凋亡的主要效應因子為Caspase-3[6,12-13]。

本研究首先采用MTT法來觀察L161982對HT29細胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在藥物干預后48 h與72 h時間點，L161982預處理細胞中各劑量組的抑制率均最高，基于上述預實驗結(jié)果，第48 h時間點作為檢測觀察點。此外，在不同劑量組同一時間點的比較中，EP4抑制劑L161982各劑量組均能抑制人結(jié)腸癌HT29細胞增殖，且抑制率隨著抑制劑濃度增大而升高，其中以L3組增殖抑制率最高。以上結(jié)果可表明抑制EP4后可明顯抑制人結(jié)腸癌細胞的增殖，且抑制增殖的作用存在較明顯的時間、劑量相關(guān)性。為了進一步探討上述抑制增殖作用是否通過誘導細胞的凋亡而實現(xiàn)，我們使用流式細胞技術(shù)和Western Blot進行檢測，后發(fā)現(xiàn)這種損傷作用以細胞凋亡為主，凋亡蛋白Caspase-3 的表達增高，Annexin V/PI檢測結(jié)果與Western Blot法檢測結(jié)果一致，Caspase-3蛋白的表達在EP4抑制劑各劑量組均明顯升高，且存在一定的量效相關(guān)性，在對照組僅有少量表達，該結(jié)果提示抑制EP4而抑制HT29細胞增殖可能是通過Caspase-3來啟動細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑。

本實驗初步表明抑制EP4能夠誘導結(jié)腸癌細胞HT29凋亡，且存在著一定的劑量相關(guān)性。綜上所述，本實驗從細胞和分子水平證實了PGE2的抑制腫瘤細胞凋亡和增加腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移作用可能是通過受體EP4這一途徑實現(xiàn)。

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(編輯：吳小紅)

Effect of EP4 on HT29 Cell Proliferation

GAOYan，JIANGHao，SUNZhiguo，etal.

HongQiHospitalofMudanjiangMedicalSchool,Mudanjiang,157011

Objective To observe the effect of prostaglandin E2 receptor4 on HT29 proliferation.Methods HT29 cells were pretreated with L161982,antagonist of EP4.MTT was added to measure the cell viability.HT29 apoptosis was measured by Flow Cytometry.Protein expression of Caspase-3 was examined by Western Blot.Results The survival rate of HT29 cells that were pretreated with L161982 was significantly lower than those without pretreatment (P<0.05).The expression levels of Caspase-3 and cell apoptosis increased significantly after pretreatment.Conclusion EP4 is involved in the pathogenesis of HT29 cells proliferation and apoptosis induced by L161982,and this may be molecular mechanism of proliferation of colon cancer cells.

Prostaglandin E2；Prostaglandin EP4；HT29

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(No.2011-308)

157011黑龍江省牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院(高 巖，姜 浩，孫治國)；157000 中國人民解放軍93383部隊醫(yī)院(高 健)

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.002

R735.3+7

A

1001-5930(2014)12-1518-04

2014-07-08

2014-09-14)