萬 軍 車 云 康寧寧

信號通路蛋白Akt1、ERK1/2與HIF-1α在肺癌組織中的表達及其臨床意義

萬 軍 車 云 康寧寧

目的 探討信號通路蛋白Akt1、ERK1/2與HIF-1α在肺癌組織中的表達及其臨床意義。方法 采用免疫組化方法(Envision二步法)，檢測100例肺癌Akt1、ERK1/2和HIF-1α蛋白表達情況。結果 Akt1、ERK1/2及HIF-1α蛋白在肺癌組織中均呈不同程度表達，其陽性表達率分別為63.00%、68.00%和52.00%；Akt1與HIF-1α表達具有明顯相關性(γ=0.673，P=0.000)，ERK1/2與HIF-1α表達亦具有明顯相關性(γ=0.568，P=0.000)；Akt1、ERK1/2和HIF-1α表達均與肺癌分化程度、淋巴結轉移及TNM分期有關(P<0.01)。結論 Akt1、ERK1/2和HIF-1α在肺癌中均呈高水平表達，Akt1、ERK1/2與HIF-1α表達具有明顯相關性，三者均與肺癌分化程度、淋巴結轉移及TNM分期有關，三者聯(lián)合檢測對肺癌診斷、治療及預后具有重要意義。

Akt1；ERK1/2；HIF-1α；肺癌

(ThePracticalJournalofCancer，2014，29：1515～1517)

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，最新研究報道肺癌的死亡率仍居各種腫瘤的首位[1]。隨著我國疾病譜的改變，肺癌已成為我國城鄉(xiāng)惡性腫瘤死亡首要原因，占全部惡性腫瘤死亡的22.7%[2]。近年來，肺癌的發(fā)病率逐年遞增，引起廣泛的關注[3]。肺癌晚期常是難治愈的，化療是晚期肺癌的主要治療手段之一，此時的治療目標是減輕癥狀、提高生活質量、延長壽命。對于患者來說，提高其生活質量更有切身的好處。缺氧誘導因子1α(HIF-1α)蛋白在大多數(shù)腫瘤組織及其轉移灶中高表達，腫瘤細胞內HIF-1α蛋白水平的調控除了受到環(huán)境氧濃度影響外還存在其他調控機制[4]。細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)與蛋白激酶B(protein kinase，PKB，Akt)均在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的調控作用，本文對我院收治的肺癌患者進行肺癌組織中HIF-1α與Akt1、ERK1/2表達的水平，探討HIF-1α與Akt1，HIF-1α與ERK1/2表達水平的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2012年6月-2014年6月我院收治的肺癌患者100例，其中男性55例，女性45例；年齡56～85歲，平均(65.9±13.8)歲。所有病例均參照世界衛(wèi)生組織2007年公布的診斷標準，其中鱗癌26例(高中分化15，低分化11例)；淋巴結轉移14例，無淋巴結轉移12例；TNMⅠ～Ⅱ期20例，Ⅲ期6例)，腺癌61例(高中分化33，低分化28例)；淋巴結轉移39例，無淋巴結轉移22例；TNMⅠ～Ⅱ期40例，Ⅲ期21例)，小細胞肺癌13例(高中分化5，低分化8例；均發(fā)生淋巴結轉移；TNMⅠ～Ⅱ期7例，Ⅲ期6例)。

1.2 試劑

Akt1兔抗人單克隆抗體，HIF-1α鼠抗人單克隆抗體，ERK1/2鼠抗人單克隆抗體為Epigentek公司生產。氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒及Envision二步法免疫組化試劑盒均為中杉金橋生產。

1.3 方法

1.3.1 標本取材 經我院倫理委員會論證批準，收集患者術中切除肺癌組織，于術后2 h內完成標本取材，標本均經10%甲醛固定，梯度酒精脫水、石蠟包埋，備用。

1.3.2 病理組織學檢查 將患兒標本4 μm連續(xù)切片6～7張，行常規(guī)病理檢查(HE，MASSON，PAS，PASM+MASSON)，采用高清晰度圖文分析系統(tǒng)進行分析。

1.3.3 Akt1、ERK1/2及HIF-1α表達檢測 采用Envision二步法進行Akt1、ERK1/2及HIF-1α表達定位及半定量分析。嚴格按試劑盒說明書進行操作。標本經4 μm連續(xù)切片，置60℃烤箱60 min烤干。經二甲苯脫蠟，酒精梯度水化至蒸餾水。3%過氧化氫室溫處理15 min，阻斷內源性過氧化物酶，蒸餾水洗滌2 min，微波修復抗原10 min，滴加一抗：ERK1/2鼠抗人單克隆抗體，Akt1兔抗人單克隆抗體，HIF-1α鼠抗人單克隆抗體用PBS按1∶100稀釋，每張切片滴加稀釋的一抗50 μl，4 ℃孵育過夜。次日PBS沖洗切片3次，每次3～5 min。每張切片滴加二抗生物素化羊抗兔IgG 50 μl，在37 ℃恒溫箱孵育30 min。PBS沖洗切片3次，每次3～5 min。每張切片滴加DAB 50 μl顯色，蘇木精復染，脫水，中性樹脂封片。陰性對照以PBS緩沖液代替一抗。每張切片隨機抽取5個高倍鏡下視野，計算陽性細胞百分數(shù)。

1.3.4 結果判定 應用彩色病理圖像分析系統(tǒng)在高倍鏡下測定免疫組化結果。肺癌切片中出現(xiàn)棕黃或棕黑色物為Akt1、ERK1/2及HIF-1α陽性染色，不著色為陰性。分級標準：Photoshop軟件圖像分析測量陽性染色區(qū)域占總面積的百分比。所有區(qū)域陽性染色面積<10%為(-)，11%～50%定為(+)，51%～80%定為(++)，>81%定為(+++)。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0軟件進行分析處理，Kruskal-Walls檢驗用于多個獨立樣本差異比較，相關性分析采用Spearman等級。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Akt1、ERK1/2及HIF-1α表達形態(tài)特征

免疫組化結果顯示，Akt1、ERK1/2及HIF-1α蛋白在肺癌組織中均呈不同程度表達，分別有63例、68例和52例檢出，其陽性率分別為63.00%、68.00%和52.00%。Akt1、ERK1/2及HIF-1α蛋白表達陽性細胞胞質或胞膜呈粗細不等的棕黃色顆粒，陰性細胞胞質胞膜均不著色，胞核呈紫藍色。

2.2 Akt1、ERK1/2與HIF-1α表達相關性

Akt1、ERK1/2與HIF-1α表達相關性Spearman分析結果分別見表1和表2。結果顯示，Akt1與HIF-1α表達具有明顯相關性(γ=0.673，P=0.000)，ERK1/2與HIF-1α表達亦具有明顯相關性(γ=0.568，P=0.000)。

表1 Akt1與HIF-1α表達相關性

表2 ERK1/2與HIF-1α表達相關性

2.3 Akt1、ERK1/2和HIF-1α表達與肺癌臨床病理指標的關系

Akt1、ERK1/2和HIF-1α表達均與肺癌分化程度、淋巴結轉移及TNM分期有關(P<0.01)，分化程度高，淋巴結發(fā)生轉移和TNM分期高的患者Akt1、ERK1/2和HIF-1α陽性表達率也高，見表3。

表3 Akt1、ERK1/2和HIF-1α與肺癌臨床病理指標的關系

3 討論

細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)是多種生長因子、細胞因子調控細胞增殖的重要途徑，具有調控細胞發(fā)育、分化、周期循環(huán)等功能，在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用[5]。蛋白激酶B(protein kinase，PKB，Akt)是PI3K /Akt信號轉導通路，的關鍵分子，其活化受控于嚴密精確的分子機制，多種疾病如癌癥和糖尿病常伴隨Akt調控的紊亂[6-7]。李龍等報道證實，ERK1/2在肺癌及外周組織中的表達水平顯著高于正常組織，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中其重要的作用，且與表皮生長因子受體表達明顯相關[8]。然而有關Akt1、ERK1/2與HIF-1α在肺癌組織中的相關性分析未見報道。

本文同時檢測了不同分期及病變肺癌組織中Akt1、ERK1/2和HIF-1α的表達水平。結果顯示，Akt1、ERK1/2及HIF-1α蛋白在肺癌中均有不同程度的表達，分別有63例、68例和52例檢出，其陽性率分別為63.00%、68.00%和52.00%，表明Akt1、ERK1/2和HIF-1α在肺癌中均呈高表達的水平。谷艷嬌等[9]同樣報道ERK1/2在肺癌組織中的高表達態(tài)勢。

缺氧誘導因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)哺乳動物中廣泛存在的轉錄因子，在缺氧狀態(tài)下由血管生成，可影響其他細胞因子的表達[10]。本文中分別對Akt1、ERK1/2與HIF-1α的表達相關性分析顯示，Akt1與HIF-1α表達具有明顯的相關性(γ=0.673，P=0.000)，ERK1/2與HIF-1α表達亦具有明顯的相關性(γ=0.568，P=0.000)。PKB/Akt在多種癌癥中具有重要作用，在乳腺和前列腺癌細胞中PKB/Akt激活后，通過調節(jié)HIF-α調節(jié)表皮生長因子受體的表達，而表皮生長因子受體是導致腫瘤發(fā)生的重要因素[11]。因此，本文認為，Akt1與HIF-1α的表達相關性證明在肺癌細胞中PKB/Akt通路通過調節(jié)HIF-1α的表達水平參與到肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中。有關ERK1/2與HIF-1α表達的相關性報道較少。ERK是MAPK家族成員之一，屬于絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶，活化后進入細胞核作用于多種轉錄因子和蛋白激酶等，而HIF-1α主要位于細胞核，因此本文推斷HIF-1α可能為ERK1/2的主要下游調節(jié)成員之一。HIF-1主要由α和β兩個亞基以異源二聚體的形式存在，前者是其氧調節(jié)單位，正常生理條件下微環(huán)境的氧濃度通過調控HIF-1α的降解速度來控制HIF-1對下游基因的轉錄調控活性。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)Akt1、ERK1/2和HIF-1α均與肺癌分化程度、淋巴是否轉移及TNM分期有關(P<0.01)，分化程度高，淋巴轉移和TNM分期高的患者Akt1、ERK1/2和HIF-1α陽性表達率高。提示Akt1、ERK1/2和HIF-1α可作為肺癌早期診斷的標志物之一，具有成為肺癌新藥研發(fā)的靶點之一的潛質，參與到了肺癌發(fā)生、進展、轉移及復發(fā)的各個環(huán)節(jié)。

綜上所述，Akt1、ERK1/2和HIF-1α在肺癌中均呈高表達的水平，Akt1、ERK1/2與HIF-1α表達具有明顯的相關性，三者均與肺癌分化程度、淋巴是否轉移及TNM分期有關，聯(lián)合檢測三者對肺癌診斷、治療及預后具有重要意義。

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(編輯：吳小紅)

Correlation of Signal Pathway Protein Akt1、ERK1/2 and HIF-1α Expression in Lung Cancer Tissues and Their Clinical Significance

WANJun，CHEYun，KANGNingning.

TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei，230022

Objective To investigate the expression of signal pathway protein Akt1、ERK1/2 and HIF-1α in lung cancer tissues and their clinical significance.Methods Expression of Akt1、ERK1/2 and HIF-1α in 100 cases of lung cancer were detected by Envision two-step immunohistochemical method.Results Akt1、ERK1/2 and HIF-1α were all found expressed in lung cancer tissues and the positive expression rates were 63.00%，68.00% and 52.00%，respectively；There was significant correlation between expression of Akt1 and HIF-1α (γ=0.673，P=0.000)，and there was significant correlation between expression of ERK1/2 and HIF-1α (γ=0.568，P=0.000)；The expression of Akt1、ERK1/2 and HIF-1α were correlated with differentiation degree，lymphatic metastasis and TNM staging (P<0.01).Conclusion High expression of Akt1、ERK1/2 and HIF-1α in lung cancer tissue is observed.Akt1、ERK1/2 and HIF-1α are closely correlated，and they are all correlated with differentiation degree，lymphatic metastasis and TNM staging.Combined detection of Akt1、ERK1/2 and HIF-1α is of vital significance for diagnosis，treatment and prognosis of lung cancer.

Akt1；ERK1/2；HIF-1α；Lung cancer

國家自然科學基金(編號：81302028)；安徽省自然科學基金(編號：1208085QH159)

230022 安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院普胸外科

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.002

R734.2

A

1001-5930(2014)12-1515-03

2014-10-08

2014-10-20)