朱 蓉，趙 逵，方興國，狄連君，陳小燕

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 貴州 遵義 563099)

Achaete scute-like 2 (Ascl2)是一個(gè)與腸干細(xì)胞相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，是Wnt信號途徑的靶分子之一[1]，目前研究發(fā)現(xiàn)，Ascl2不僅控制成體腸干細(xì)胞的“命運(yùn)”[2]：在小鼠腸上皮中轉(zhuǎn)基因過表達(dá)Ascl2出現(xiàn)腸隱窩過度增生和腸絨毛異位隱窩出現(xiàn)，在成體小鼠腸道誘導(dǎo)Ascl2基因表達(dá)缺失導(dǎo)致Lgr5陽性的成體腸隱窩干細(xì)胞在數(shù)天后消失；而且，Ascl2還與結(jié)腸癌相關(guān)，其調(diào)控結(jié)腸癌干細(xì)胞“干性”[3-4]。本研究通過成功構(gòu)建Ascl2的RNAi質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，通過G418篩選、挑取克隆并擴(kuò)增培養(yǎng)形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，再將該細(xì)胞移植到裸鼠皮下，并采用小動物活體成像儀觀察Ascl2干擾前后HT-29細(xì)胞的致瘤能力，以探討Ascl2-RNAi對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞體內(nèi)生長增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫(該細(xì)胞株引自ATCC)； 胎牛血清購自Hyclone公司；Macoy’s 5A培養(yǎng)基購自Sigma公司； LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；抗Ascl2單克隆抗體購自Millipore公司；激光共聚焦掃描顯微鏡購自德國 Carl Zeiss公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司；小動物活體成像儀Maestro EX2.10(第三軍醫(yī)大學(xué)燒傷研究所)購自美國CRI。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒構(gòu)建以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立

1.2.1 細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29培養(yǎng)于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A完全培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中，每2～3天換液1次，細(xì)胞生長融合至70%～80%，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建與測序 對照質(zhì)粒shRNA-control/EGFP以及shRNA-Ascl2/EGFP質(zhì)粒均由武漢市晶賽生物工程有限公司合成，經(jīng)文獻(xiàn)查得Ascl2干擾片段的序列為CCGCGTGAAGCTGGTGAAC[2 ]，由此設(shè)計(jì)合成的DNA模板引物為：

5’-CACCGCCGCGTGAAGCTGGTGAACTTCAAGACGGTTCACCAGCTTCACGCGGTTTTTTG-3',

5’-AGCTCAAAAAACCGCGTGAAGCTGGTGAACCGTCTTGAAGTTCACCAGCTTCACGCGGC-3'.

將合成的片段進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明構(gòu)建的Ascl2干擾質(zhì)粒目的片段與預(yù)期序列完全相符。

1.2.3 Ascl2-RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞 取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞生長至50%～60%融合時(shí)，按LipofectamineTM2 000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將2 μL shRNA-Ascl2/EGFP質(zhì)粒溶液加入到37 ℃預(yù)熱的無血清無雙抗培養(yǎng)基48 μL，共50 μL，室溫孵育5 min；將2 μL LipofectamineTM2000試劑加入到37 ℃預(yù)熱的無血清無雙抗培養(yǎng)基48 μL，共50 μL，室溫孵育5 min；將2種溶液輕輕混勻，室溫孵育20 min，加入24孔板中，100 μL/孔，輕輕搖動孔板混勻，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后采用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光的表達(dá)情況。

1.2.4 G418抗性篩選，克隆挑取及擴(kuò)增培養(yǎng) HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入篩選濃度的G418篩選培養(yǎng)基(G418篩選濃度為800 μg/mL)，每隔3～5 d換液1次。當(dāng)非熒光細(xì)胞幾乎被完全殺死時(shí)，降低G418濃度，采用維持濃度(G418維持濃度為400 μg/mL) 維持細(xì)胞的篩選。3～4周后可見培養(yǎng)板底有細(xì)胞克隆形成，進(jìn)一步采用激光共聚焦顯微鏡觀察所形成的細(xì)胞克隆綠色熒光的表達(dá)情況，并作好標(biāo)記，將標(biāo)記好的陽性克隆用100 μL槍頭進(jìn)行挑取，移至加有1 mL完全培養(yǎng)液的24孔板中，加入維持濃度的G418，繼續(xù)培養(yǎng)，激光共聚焦鏡觀察培養(yǎng)的細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況，繼續(xù)擴(kuò)增，消化、傳代培養(yǎng)，凍存，分別建立shRNA-Ascl2/HT-29和shRNA-control/HT-29兩個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測GFP陽性細(xì)胞比例 常規(guī)消化、離心細(xì)胞，用流式緩沖液混懸細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為GFP陰性對照。

1.4 western-blot檢測Ascl2的干擾效果 裂解細(xì)胞、收集蛋白質(zhì)標(biāo)本，配膠、上樣、垂直電泳，制作“三文治”結(jié)構(gòu)、電轉(zhuǎn)，封閉、洗膜，加一抗(抗Ascl2單克隆抗體 1:1000)，洗膜、加二抗，曝光(根據(jù)效果調(diào)整時(shí)間)，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.5 小動物活體成像儀觀察Ascl2-RNAi對HT-29細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響 4～6周齡的BALB/c裸鼠6只用于成瘤實(shí)驗(yàn)。常規(guī)消化、離心細(xì)胞，用生理鹽水混懸細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)板反復(fù)多次計(jì)數(shù)后，以1×106細(xì)胞(體積：100 μL)接種于裸鼠的背部皮下，左右均接種1×106細(xì)胞，左側(cè)為干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，右側(cè)為對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。每日觀察裸鼠的狀態(tài)、瘤子的生長狀況，并記錄瘤子的長、短徑。第20天時(shí)，對裸鼠進(jìn)行麻醉、小動物活體成像儀觀察拍照，處死裸鼠，解剖出瘤子后測量大小、稱取重量，并做好記錄。

2 結(jié)果

2.1 激光共聚焦顯微鏡觀察Ascl2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞 激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，Ascl2對照和干擾質(zhì)粒(shRNA-control/EGFP和shRNA-Ascl2/EGFP)轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞48 h(見圖1 A～C)，其轉(zhuǎn)染效率均低于20%，進(jìn)行G418篩選3～4周后，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆(見圖1 D～F)，進(jìn)一步消化、傳代，擴(kuò)增培養(yǎng)(見圖1 G～I(xiàn))，分別建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細(xì)胞系，并命名為shRNA-Ctr/HT-29(shRNA-control/HT-29)和shRNA-Ascl2/HT-29細(xì)胞。

注：A～C為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h,D～F為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆,G～I(xiàn)為擴(kuò)增培養(yǎng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。圖1 Ascl2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞情況

2.2 流式細(xì)胞儀檢測GFP陽性HT-29細(xì)胞比例 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、經(jīng)G418篩選出來的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆經(jīng)傳代、擴(kuò)增培養(yǎng)，檢測GFP陽性細(xì)胞比例達(dá)90%以上(見圖2 )。

注：A：陰性對照細(xì)胞GFP陽性比例；B:Ascl2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞GFP陽性比例。圖2 流式細(xì)胞儀檢測GFP陽性細(xì)胞比例

2.3 western-blot檢測Ascl2質(zhì)粒的干擾效果 對HT-29、shRNA-Ctr/HT-29和shRNA-Ascl2/HT-29細(xì)胞進(jìn)行Ascl2蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測，western-blot結(jié)果顯示，干擾后細(xì)胞中Ascl2蛋白質(zhì)表達(dá)明顯下調(diào)(見圖3 )。

注：A為western-blot檢測HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-Ascl2/HT-29細(xì)胞中Ascl2蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，B為蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)柱狀圖(**P<0.01 )。圖3 Ascl2干擾效果的檢測

2.4 小動物活體成像觀察Ascl2-RNAi對HT-29細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用 為了觀察干擾Ascl2對HT-29細(xì)胞裸鼠致瘤能力的影響，轉(zhuǎn)染Ascl2干擾質(zhì)粒和對照質(zhì)粒細(xì)胞分別以1×106/只注射于裸鼠左側(cè)和右側(cè)背部皮下，每間隔5 d測量1次瘤體積，20 d后，所有的裸鼠均致瘤，麻醉后采用小動物活體成像儀觀察shRNA-Ctr/HT-29和shRNA-Ascl2/HT-29細(xì)胞裸鼠皮下致瘤情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ascl2干擾后的HT-29細(xì)胞致瘤能力明顯減弱(見圖4A)。脫頸法處死裸鼠，測量瘤體積，取出瘤子稱量瘤質(zhì)量。轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的HT-29細(xì)胞所致腫瘤體積和質(zhì)量均小于轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的HT-29細(xì)胞所致腫瘤體積和質(zhì)量(見圖4B、C)。

注：A：小動物活體成像儀觀察裸鼠移植瘤的生長情況，左側(cè)：Ascl2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HT-29細(xì)胞致瘤，右側(cè)：對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HT-29細(xì)胞致瘤；B：裸鼠移植瘤體積生長情況；C：移植瘤質(zhì)量比較柱狀圖(*P<0.05)。圖4 Ascl2-RNAi對HT-29細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用

3 討論

結(jié)腸癌是人類消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈上升趨勢。中晚期結(jié)腸癌治療困難、療效差，目前盡管強(qiáng)調(diào)綜合性、個(gè)體化治療，但終不能解決根本問題。經(jīng)過國內(nèi)外研究者的努力，提出了腫瘤干細(xì)胞這一全新的理論，該理論認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞才是腫瘤生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。而以腫瘤干細(xì)胞為治療靶點(diǎn)，才能從根本上根除腫瘤、防止其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而不僅僅是以減小腫瘤體積為治療目標(biāo)[5]。Ascl2是一個(gè)可能與結(jié)腸癌干細(xì)胞“干性”密切相關(guān)的堿性/螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子[4]，深入研究其對結(jié)腸癌生長的影響及機(jī)制，可能為將Ascl2作為結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)采用RNAi技術(shù)對體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞進(jìn)行研究，成功構(gòu)建了Ascl2 的RNAi質(zhì)粒，并對HT-29細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，然后G418篩選，形成穩(wěn)定的克隆后進(jìn)行挑選并擴(kuò)增培養(yǎng)形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HT-29細(xì)胞系，確定干擾效果后對裸鼠進(jìn)行皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)，采用小動物活體成像技術(shù)觀察移植瘤的熒光表達(dá)情況和瘤體生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HT-29細(xì)胞經(jīng)Ascl2干擾后，皮下移植瘤的生長能力明顯減弱，說明Ascl2與結(jié)腸癌的生長密切相關(guān)，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，Ascl2可能成為一個(gè)結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)，且Ascl2表達(dá)局限，研究報(bào)道其表達(dá)僅限于腸道隱窩基底的Lgr5陽性的腸成體干細(xì)胞以及胎盤[2]，該轉(zhuǎn)錄因子作為結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)可能具有靶向性好和副作用小等更多的優(yōu)勢。

小動物活體成像儀能夠直觀的觀察到瘤體綠色熒光表達(dá)情況，并可以在整個(gè)過程中動態(tài)觀察，可以作為一種很好的研究手段用于活體小動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移研究[6]。小動物活體成像技術(shù)機(jī)理是：通過活體腫瘤、細(xì)胞或基因的生物發(fā)光以及熒光標(biāo)記，采用制冷CCD(高靈敏度)配合特制的成像暗箱，再用圖像軟件進(jìn)行處理，從而直觀觀測活體小動物體內(nèi)腫瘤的生長、遷移、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，以及細(xì)胞活動，甚至可以觀測特定基因的表達(dá)，還可通過標(biāo)記細(xì)菌或病毒從而觀測感染性疾病的發(fā)展等生物學(xué)過程[6-7]。該技術(shù)觀察靈敏度高、結(jié)果直觀，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測、動態(tài)觀察和定量評估，操作簡單、安全，不涉及反(放)射性物質(zhì)，且實(shí)驗(yàn)成本低。因此，目前小動物活體成像技術(shù)在國內(nèi)外得到越來越多的應(yīng)用，也極大地促進(jìn)了生命科學(xué)特別是腫瘤研究的發(fā)展[8-12]，該技術(shù)值得推廣。

本實(shí)驗(yàn)在整個(gè)過程中觀察到綠色熒光表達(dá)沒有衰減，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的成功以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具有一定的時(shí)效性，短時(shí)間內(nèi)不會衰減，可以作為一種很好的經(jīng)濟(jì)的研究手段，而不是一定要進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染等較高費(fèi)用的研究。我們作為西部地區(qū)的科研單位，采用這種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的研究手段，爭取能為醫(yī)學(xué)事業(yè)和整個(gè)人類的健康做出更大的貢獻(xiàn)。

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