楊勝波，龍 勝，易曉東，于建奇

(遵義醫(yī)學(xué)院 解剖學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

臀部外上象限肌內(nèi)注射神經(jīng)毒性藥物如青霉素，安乃近，氯丙嗪，奎寧等意外引起坐骨神經(jīng)損傷是一種可避免但又持續(xù)的全球性問題，尤其是發(fā)展中國家6歲以下兒童下肢肌萎縮而殘疾的主要原因[1-4]。已有資料報道，失神經(jīng)肌萎縮過程中，有的肌纖維型不穩(wěn)定，可發(fā)生相互轉(zhuǎn)換和選擇性肌肉萎縮[5]，這與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化還原酶(NADH-TR)活性狀態(tài)有關(guān)[6]。骨骼肌失神經(jīng)后，膠原合成酶活性成倍上升，大量膠原纖維聚集可以阻止失神經(jīng)肌肉神經(jīng)再支配，造成失神經(jīng)骨骼肌萎縮[7]。針灸是中國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，目前日益普及，作為西方世界的醫(yī)學(xué)補(bǔ)充和替代的重要方式。針刺能明顯改善骨骼肌萎縮，促進(jìn)運(yùn)動功能的恢復(fù)[8-9]。因此，本研究擬建立注射性坐骨神經(jīng)損傷動物模型，導(dǎo)致下肢肌肉萎縮，然后針刺腧穴干預(yù)，觀察針刺對小腿骨骼肌內(nèi)NADH-TR和膠原纖維產(chǎn)生的影響，分析針刺效應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 成年家兔42只，不拘雌雄，2.0±0.5kg，來自遵義醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。根據(jù)注射性坐骨神經(jīng)損傷后2周肉眼可見骨骼肌體積縮小，4周明顯萎縮，以及肌萎縮的針灸治療4周可見療效[8，10]， 將動物分為7組：正常組6只；青霉素注射坐骨神經(jīng)2周、4周組各6只；青霉素注射坐骨神經(jīng)加針刺腧穴4周、8周組各6只，青霉素注射坐骨神經(jīng)加針刺尾部4周、8周對照組各6只。

1.2 實驗方法

1.2.1 注射性坐骨神經(jīng)損傷動物模型的建立與穴位針刺治療 2.5%戊巴比妥鈉25 mg/kg耳緣靜脈緩慢注射麻醉。股后區(qū)常規(guī)消毒，逐層切開，顯露坐骨神經(jīng)干，在神經(jīng)干后面中線上進(jìn)針，注射0.5 mL/20萬U青霉素于神經(jīng)外膜下[10]，逐層關(guān)閉切口，單籠飼養(yǎng)。注射青霉素4周，待下肢肌肉明顯萎縮后，取后三里、三陰交和環(huán)跳穴配伍治療[10-11]。33號毫針刺入穴位，捻轉(zhuǎn)40～50次/min，留針30 min，1次/d，10 d為1療程，間隔3 d，續(xù)下一療程，治療4、8周。對照組不取腧穴，僅隨意針刺尾部組織。

1.2.2 大體觀察與肌重測量 觀察家兔步態(tài)后，空氣栓塞處死。取下各組腓腸肌外側(cè)頭，觀察肌塊大小及色澤變化，稱量肌重。

1.2.3 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化還原酶(NADH-TR)染色法和Van Gieson(VG)苦味酸酸性復(fù)紅染色法 空氣栓塞處死家兔，取下腓腸肌。因腓腸肌較大，有內(nèi)、外側(cè)頭，本實驗只檢測損傷側(cè)腓腸肌外側(cè)頭(右側(cè))，采用NADH-TR組化染色法和VG染色法，分別顯示肌內(nèi)NADH-TR和膠原纖維的變化。具體染色方法見我們之前的研究[6]。

1.2.4 肌纖維型構(gòu)成比、平均光密度和肌纖維橫切面積測量 NADH-TR染色后，在Leica圖象分析儀下，每例測數(shù)10張切片，每張切片隨機(jī)測數(shù)10個視野，每視野面積為500×500 μm2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)作t檢驗和單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察和肌重變化 青霉素注射坐骨神經(jīng)2周后，可見損傷側(cè)下肢明顯拖曳步態(tài)，4周時更嚴(yán)重，小腿外觀變細(xì)，腓腸肌萎縮變小，無光澤。針刺腧穴治療4周后，步態(tài)、肌塊色澤與大小明顯恢復(fù)，8周時進(jìn)一步恢復(fù)。 針刺尾部對照組變化不大。正常家兔腓腸肌外側(cè)頭肌重為(2.74±0.39)g。青霉素注射坐骨神經(jīng)損傷后2周，肌重降為1.82 g，4周時，繼續(xù)下降至1.46 g，即下降了46.71%，針刺環(huán)跳、后三里和三陰交治療4周，可見回升，8周時已恢復(fù)至正常的90. 29%。針刺尾部回升不明顯，4 周 和8周時分別為1.84 g和1.85 g。各組各值之間的比較，P<0.01。

2.2 NADH-TR染色

2.2.1 染色所見 正常腓腸肌外側(cè)頭的橫切片上，能明顯區(qū)分出三型肌纖維。Ⅰ型纖維橫切面積最小，著色最深，胞漿內(nèi)藍(lán)紫色顆粒細(xì)小，均勻分布；ⅡB型纖維橫切面積最大，著色最淺，染色顆粒在胞漿周邊要多于中央；ⅡA型纖維介于兩者之間，染色中等，胞漿內(nèi)染色顆粒粗大，在肌膜下分布多于中央。三型肌纖維鑲嵌排列，可見同型纖維類聚現(xiàn)象(見圖1A)。青霉素注射坐骨神經(jīng)損傷2周后，切片顏色加深，纖維橫切面不規(guī)整，邊界開始模糊不清楚，染色顆粒不均勻，尚能分辨。Ⅰ型和Ⅱ型纖維的比例保持不變，ⅡA型纖維的比例增加，ⅡB型纖維相應(yīng)減少，4周時進(jìn)一步加重(見圖1B，C)。針刺腧穴治療4周后，ⅡA型纖維的比例下調(diào)，ⅡB型纖維相應(yīng)增加，切片著色變淺；治療8周，肌纖維橫斷面著色與比例進(jìn)一步恢復(fù)，接近正常(見圖1D，E)。針刺尾部4～8周，切片染色仍在加深，Ⅰ型和ⅡA型肌纖維界限更不清楚，分辨已困難(見圖1F，G)。

2.2.2 肌纖維型構(gòu)成比變化 各實驗組腓腸肌外側(cè)頭內(nèi)三型肌纖維的構(gòu)成比(見表1)。青霉素注射坐骨神經(jīng)損傷后2周，腓腸肌外側(cè)頭內(nèi)Ⅰ型纖維含量變化不大，ⅡA型肌纖維百分比增加9.14%，4周時，增加了11.75%。ⅡB型肌纖維相應(yīng)地減少。針刺腧穴治療4周，ⅡA型纖維回落4.54%，8周時繼續(xù)回落9.98%，ⅡB型肌纖維相應(yīng)地增加，恢復(fù)接近正常。針刺尾部4～8周，ⅡA型肌纖維比例上升和ⅡB型纖維下降仍然漸進(jìn)性加重。ⅡA和ⅡB型肌纖維的各組各值之間的q檢驗，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。

注：其中圖A的標(biāo)尺為50μm，圖B～G為200μm。圖A顯示正常腓腸肌外側(cè)頭內(nèi)橫切的三型肌纖維，即Ⅰ、ⅡA和ⅡB型纖維；圖B和C分別顯示青霉素注射坐骨神經(jīng)損傷2周和4周；圖D和E分別顯示針刺腧穴4周和8周；圖F和G分別顯示針刺尾部對照4周和8周。圖1 NADH-TR染色結(jié)果

2.2.3 三型肌纖維平均光密度值測定 各實驗組腓腸肌外側(cè)頭內(nèi)三型肌纖維的平均光密度值(見表2)。正常腓腸肌外側(cè)頭內(nèi)三型肌纖維的平均光密度值分別是0.59±0.02、0.32±0.02、0.23±0.01。各實驗組Ⅰ型和ⅡB型纖維的平均光密度值變化不大，其各值之間的比較，P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。青霉素注射坐骨神經(jīng)損傷后2周，ⅡA型肌纖維光密度值增大，4周時增大了0.50倍，針刺腧穴治療4周后，光密度值下降，治療8周時，進(jìn)一步下降，恢復(fù)了91.63%。針刺尾部4周，光密度值無下降，反而繼續(xù)增大，8周時已為0.50±0.04，接近正常Ⅰ型纖維的平均光密度值。ⅡA型肌纖維光密度值各組之間的比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2.4 三型肌纖維橫切面積變化 各實驗組腓腸

肌外側(cè)頭內(nèi)三型肌纖維的橫切面積(見表3)。青霉素注射坐骨神經(jīng)后，三型肌纖維開始萎縮變細(xì)，2周時，其橫切面積分別下降了22.36%、23.10%、24.06%；4周時，進(jìn)一步下降了37.11%、38.36%、39.45%。針刺腧穴2周后，分別恢復(fù)了27.51%、27.88%、28.77%；4周時，已經(jīng)回升至正常的94.65%、93.35%、94.52%。針刺尾部4～8周，可見肌纖維橫切面積在神經(jīng)損傷4周基礎(chǔ)上漸進(jìn)性縮小。各組各值之間的q檢驗，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 VG染色所見 正常腓腸肌外側(cè)頭橫切片內(nèi)，在肌束與肌束間可見少許膠原纖維著為紅色，肌纖維染為黃色，細(xì)胞核呈黑色(見圖2A)。青霉素注射坐骨神經(jīng)損傷后2周，膠原纖維已明顯增生，4周時，膠原纖維更紅，條索更粗(見圖2B，C)；針刺治療4周時膠原纖維有所減少；8周時明顯減少，稍多于正常(見圖2D，E)；針刺尾部4～8周,可見腓腸肌外側(cè)頭內(nèi)膠原纖維比青霉素注射坐骨神經(jīng)損傷4周時更多，網(wǎng)狀的紅色纖維穿越肌實質(zhì)，滿布視野(見圖2F，G)。

組別腓腸肌外側(cè)頭Ⅰ型(%)ⅡA型(%)ⅡB型(%)正常組15．61±3．2215．61±3．2224．68±3．45注射青霉素2周15．66±2．2065．17±3．3619．17±3．44注射青霉素4周15．82±3．6766．73±2．9517．45±2．37注射青霉素加針刺腧穴4周15．69±3．3563．70±1．3720．16±3．35注射青霉素加針刺腧穴8周15．64±2．7360．07±4．2824．29±2．74注射青霉素加針刺尾部4周15．83±2．5667．03±1．8617．14±4．28注射青霉素加針刺尾部8周15．85±2．5869．31±1．2214．84±3．83

組別腓腸肌外側(cè)頭Ⅰ型ⅡA型ⅡB型正常組0．59±0．020．32±0．020．23±0．01注射青霉素2周0．60±0．030．38±0．030．24±0．03注射青霉素4周0．61±0．040．48±0．040．24±0．02注射青霉素加針刺腧穴4周0．60±0．020．41±0．010．23±0．04注射青霉素加針刺腧穴8周0．60±0．010．36±0．020．23±0．01注射青霉素加針刺尾部4周0．60±0．020．50±0．040．23±0．03注射青霉素加針刺尾部8周0．60±0．020．56±0．020．21±0．03

組別腓腸肌外側(cè)頭Ⅰ型(μm2)ⅡA型(μm2)ⅡB型(μm2)正常組578．23±21．46687．84±31．64761．56±34．53注射青霉素2周441．90±23．74528．95±27．67600．41±27．67注射青霉素4周342．31±36．93440．56±28．38473．08±39．85注射青霉素加針刺腧穴4周381．95±27．47478．01±32．85511．49±31．48注射青霉素加針刺腧穴8周515．20±31．53577．09±28．47647．71±25．73注射青霉素加針刺尾部4周332．02±23．68431．02±27．83458．51±26．53注射青霉素加針刺尾部8周319．58±31．89426．44±35．73450．66±25．74

注：其中圖A～G的標(biāo)尺均為200 μm。圖A代表正常腓腸肌外側(cè)頭橫切片，其內(nèi)的藍(lán)色箭頭指向紅色的膠原纖維；圖B和C分別代表青霉素注射坐骨神經(jīng)損傷2周和4周；圖D和E分別代表針刺腧穴4周和8周；圖F和G分別代表針刺尾部對照4周和8周。圖2 VG染色示腓腸肌外側(cè)頭內(nèi)各時間點(diǎn)膠原纖維的變化

3 討論

注射性坐骨神經(jīng)損傷可致以病人災(zāi)難性的打擊，即小腿骨骼肌萎縮而致殘。目前，骨骼肌萎縮的防治仍是全球的重大難題之一，但是，一種綠色的方法—針灸，能明顯改善骨骼肌萎縮。神經(jīng)損傷所致的肌萎縮屬于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的痿證之列，可施以足三里、三陰交，環(huán)跳等穴配伍，通過健脾益氣、補(bǔ)肝滋腎、通經(jīng)活絡(luò)，促成肌肉筋脈得以滋養(yǎng)，從而改善肌肉萎縮[8-9,11]。

注射性神經(jīng)損傷程度取決于藥物本身毒性、注射位置、劑量多少等因素[1]。注射導(dǎo)致神經(jīng)損傷的機(jī)理，普遍認(rèn)為藥物本身的毒性作用是導(dǎo)致神經(jīng)水腫變性的主要因素，其次為神經(jīng)內(nèi)外瘢痕、微血管通透性的改變及針刺傷[12]。本實驗在直視家兔坐骨神經(jīng)條件下，將青霉素0.5 mL注射于坐骨神經(jīng)外膜下，2周后，可見腓腸肌外側(cè)頭色澤變淡，肌重減輕，患側(cè)后肢跛行拖曳，4周時更重，腓腸肌外側(cè)頭明顯萎縮，達(dá)到了預(yù)期造模的目的。

無論是肌源性還是神經(jīng)源性的肌肉疾病，其特征均為肌肉組織間隙膠原的過度積聚導(dǎo)致肌肉組織的纖維化而明顯影響肌肉收縮功能[13]。失神經(jīng)骨骼肌毛細(xì)血管密度降低速度大于肌纖維喪失速度，毛細(xì)血管供給主要影響肌纖維橫切面積，毛細(xì)血管密度與NADH-TR陽性纖維成反比關(guān)系[5]。余茜等切斷Wistar大鼠坐骨神經(jīng)后,實施電針腧穴治療，發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速、肌肉動作電位、肌力恢復(fù)等明顯優(yōu)于對照組，提示針刺腧穴治療能促進(jìn)神經(jīng)再生和肌肉功能恢復(fù)[14]。本研究中采用注射青霉素導(dǎo)致坐骨神經(jīng)損傷，損傷后2周，也呈現(xiàn)ⅡA 纖維NADH TR染色加深，光密度值增大；橫切片中見膠原纖維明顯增生，肌纖維橫切面積減??；4周時更重，肌肉明顯萎縮。針刺足三里、三陰交、環(huán)跳治療4周后，ⅡA 纖維NADH TR染色著色逆轉(zhuǎn)，光密度值回降；膠原纖維減少，肌纖維橫切面積回升，肌重增加，肌塊色澤與萎縮以及拖曳好轉(zhuǎn)，治療8周時進(jìn)一步好轉(zhuǎn)，肌萎縮明顯改善，而針刺尾部對照無好轉(zhuǎn)甚至加重，各組間的比較有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1，2和表1～3)。我們認(rèn)為，注射具有神經(jīng)毒性的青霉素后，坐骨神經(jīng)發(fā)生水腫變性，肌肉失去了神經(jīng)的直接營養(yǎng)作用，支配骨骼肌的交感神經(jīng)舒張血管的節(jié)后纖維受損，加上肌肉毛細(xì)血管迅速退化，膠原纖維數(shù)隨神經(jīng)受損時間延長而明顯增多，肌纖維被越來越多的膠原纖維阻隔，肌肉供血則不足，導(dǎo)致肌重減輕及肌萎縮。針刺腧穴治療后，膠原纖維減少,肌內(nèi)毛細(xì)血管逐漸穿越膠原阻隔，肌內(nèi)營養(yǎng)供給增加，肌萎縮得到改善。

骨骼肌纖維根據(jù)生理需求的變化調(diào)整自己的形態(tài)、生化和功能特性，肌纖維型可發(fā)生相互轉(zhuǎn)換：ⅡB型?ⅡX型?ⅡA型?Ⅰ型[8]。我們的實驗結(jié)果(見圖1和表1～2)顯示：青霉素注射坐骨神經(jīng)2周時，腓腸肌外側(cè)頭內(nèi)ⅡA型纖維NADH-TR染色加深，光密度值增大，4周時更重。提示線粒體和肌漿網(wǎng)內(nèi)NADH-TR從休止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)為了激活狀態(tài)[6]，IIA型纖維比例增加，IIB型纖維相對減少, ⅡB型→ⅡA型，肌內(nèi)發(fā)生了選擇性纖維萎縮，即ⅡA型與ⅡB型萎縮相對較重。針刺穴位治療4～8周后，肌纖維型發(fā)生了轉(zhuǎn)換，即IIA型纖維百分比回落，IIB型纖維相應(yīng)回升(ⅡA型→ⅡB型)。但是，I型和II型纖維的比例始終保持不變，這些結(jié)果提示針刺腧穴能降低肌內(nèi)NADH-TR活性，導(dǎo)致肌纖維型發(fā)生逆轉(zhuǎn)，滿足肌纖維的生理需求，進(jìn)而改善了肌肉萎縮；腓腸肌外側(cè)頭內(nèi)I型纖維比較穩(wěn)定,在防治肌肉萎縮中有望成為重要靶標(biāo)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Fapojuwo O A, Akinlade T S, Gbiri C A. A three year review of sciatic nerve injection palsy in the Physiotherapy Department of a Nigerian Specialist Hospital[J]. Afr J Med Med Sci, 2008,37(4):389-393.

[2]Sevim S, Kaleagasi H. Sciatic injection injuries in adults: is dipyrone a foe to nerve[J]?Acta Neurol Belg, 2009,109(3):210-213.

[3]Sitati F C, Naddumba E, Beyeza T. Injection-induced sciatic nerve injury in Ugandan children[J]. Trop Doct, 2010,40(4):223-224.

[4]Mishra P, Stringer M D. Sciatic nerve injury from intramuscular injection: a persistent and global problem[J]. Int J Clin Pract, 2010,64(11):1573-1579.

[5]Cebasek V, Kubínová L, Janácek J, et al. Adaptation of muscle fibre types and capillary network to acute denervation and shortlasting reinnervation[J]. Cell Tissue Res, 2007,330(2):279-289.

[6]盧遠(yuǎn)興，張學(xué)真，楊勝波. 注射性坐骨神經(jīng)損傷后針刺腧穴對家兔脛骨前肌膠原纖維和NADH-TR的影響[J]. 解剖學(xué)研究， 2012，34(2)：129-134.

[7]Lehto M, Duance V C,Restall D. Collagen and fibronectin in the healing skeletal muscle njury. An immunohistochemical study of the effects of physical activity on repair of the injured gastrocnemius muscle in the rat[J]. J Bone Joint Surg, 1985,67(5):820-828.

[8]Liu F, Zou Y, Liu S, et al. Electro-Acupuncture Treatment Improves Neurological Function Associated with Downregulation of PDGF and Inhibition of astrogliosis in Rats with Spinal Cord Transection[J]. J Mol Neurosci, 2013,51(2):629-635.

[9]Onda A, Jiao Q, Nagano Y, et al. Acupuncture ameliorated skeletal muscle atrophy induced by hindlimb suspension in mice[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011,410(3):434-439.

[10]黃國鈞，黃勤挽. 醫(yī)藥實驗動物模型-制作與應(yīng)用[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2007：99-100.

[11]韓云.痿證針刺治療組方配穴探討[J]. 安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2009，28(3)：4-5.

[12] Eker H E, Cok O Y, Aribogan A. A treatment option for post-injection sciatic neuropathy: transsacral block with methylprednisolone[J]. Pain Physician, 2010,13(5):451-456.

[13]Kadler K E, Hill A, Canty-Laird E G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators[J]. Current Opinion in Cell Biology,2008,20(5):495-501.

[14]余茜，申丕強(qiáng)，李曉紅. 電針促進(jìn)周圍神經(jīng)功能康復(fù)的實驗研究[J]. 中國修復(fù)重建外科雜志，2001,15(5)：315-317.