許 潔，汪 洋，張 鏢，楊雪峰，羅 婭，封孝亞，張元梅，黃仁厚，俞 捷

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，重慶 400016；2.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 胃腸外科，貴州 遵義 563099)

壬基酚(Nonylphenol, NP)是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的典型代表，NP使用普遍，環(huán)境污染面極為廣泛，我國污染嚴(yán)重[1-2]。研究表明,NP對人和動物生長發(fā)育和繁衍有一定的影響[3-4]，因此，NP這類物質(zhì)已成為當(dāng)今國際毒理學(xué)界的重要研究領(lǐng)域或前沿。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NP可使子代大鼠的生理發(fā)育指標(biāo)和神經(jīng)發(fā)射時間延長，成年仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低[5]， NP所致神經(jīng)毒性的機制目前尚不清楚。

神經(jīng)生長相關(guān)蛋白 (growth associatedprotein-34，GAP-43)是神經(jīng)元發(fā)育、生長、再生形成的標(biāo)志蛋白質(zhì)[6]，本研究通過建立孕哺期暴露NP的仔鼠模型，觀察仔鼠斷乳期(21 d)、兒童期(60 d)腦組織皮質(zhì)部神經(jīng)元細胞GAP-43的表達，并判斷NP暴露劑量與GAP-43蛋白表達的相關(guān)性，初步探討NP引起認(rèn)知功能障礙的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物分組及處理 清潔級SD大鼠60只(動物合格證號：SCXK(渝)20070005)，按雌：雄2：1同籠交配，次日晨經(jīng)陰道涂片檢查發(fā)現(xiàn)精子者，當(dāng)日記為妊娠0 d(GD0)，將交配成功的28只孕鼠根據(jù)妊娠日期分層后隨機分配到4組，即對照組、低、中、高劑量組:分別為NP 0、50、100、200 mg/kg/day，每組6～7只，單籠飼養(yǎng)，于受孕第6天到出生后21 d哺乳期(GD6～PND21)空腹灌胃NP，對照組灌胃溶劑花生油，體積均為10 mL/kg/d。F1仔鼠21 d后按8g/100g干飼料喂食，飼養(yǎng)于相對濕度(60±5)%，溫度(20±2)℃，自然通風(fēng)，12 h光照12 h黑暗，自由取食、飲水。

1.1.2 試劑 NP純度99%(東京化成株試會社)，精制花生油(山東魯花牌)；一抗GAP-43為兔抗鼠親和純化抗體(京中山生物試劑制品有限公司)；兔抗鼠GAP-43多克隆抗體(北京中山生物試劑制品有限公司)；二抗羊抗兔(北京中杉金橋生物科技有限公司)；DAB顯色試劑盒(DAKO公司)。

1.1.3 免疫組化實驗器材 電熱恒溫水浴箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；101-2型電熱干燥箱(上海路達實驗儀器有限公司)；雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；Fx-200電子天平(北京賽多利斯電子有限公司);普通光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化步驟 ①組織固定后，常規(guī)洗滌、透明、石蠟包埋、切片。②梯度脫蠟至水。③H202室溫孵育10 min。④0.01M PBS洗2× 3 min。⑤枸櫞酸緩沖液燒開修復(fù)40 min，冷卻。⑥0.01M PBS洗2× 3 min。⑦滴加1∶100稀釋的anti-GFAP 25 μL，37 ℃孵育60 min。⑧滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫30～60 min。⑨0.01M PBS洗3×5 min。⑩DAB顯色液染色約5 min，自來水沖干凈。0.01M PBS洗3×2 min。蒸餾水洗；梯度酒精脫水，中性樹脂膠封片。

1.2.2 免疫組化圖象分析及處理 每組內(nèi)每張大鼠腦切片在皮質(zhì)和海馬區(qū)隨機挑選3個200倍視野進行拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件對每張照片進行分析得出每張照片的陽性細胞數(shù)和累積光密度值(Integral optical density，IOD)。IOD值越大，陽性表達越強。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù) 用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件錄入及分析，采用單因素方差分析做差異比較，有差異者進一步進行LSD兩兩比較，相關(guān)分析采用pearson相關(guān)分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

對照組及低劑量組仔鼠21 d、60 d皮質(zhì)部GAP-43陽性細胞數(shù)較多，呈棕黃色，胞漿染色，陽性細胞密集分布；高劑量組與對照組比較，海馬和皮質(zhì)部GAP-43陽性細胞數(shù)目很少，而且染色較淺。隨著給藥劑量和給藥時間的增加，GAP-43陽性細胞數(shù)目逐漸減少，且染色變淺。21 d各劑量組腦組織與60 d比較，GAP-43陽性細胞較小，密度較大，細胞重疊較多(見圖1～2)。

圖像分析數(shù)據(jù)顯示，孕鼠NP暴露后，21 d、60 d 高劑量組仔鼠皮質(zhì)部位GAP-43免疫反應(yīng)陽性細胞平均數(shù)目、積分光密度低于對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05) ，中、低劑量組與對照組相比，未見顯著性差異；且21 d、60 d仔鼠皮質(zhì)部位GAP-43陽性細胞數(shù)與NP暴露劑量呈負相關(guān)(r=-0.537、-0.697，P<0.05)；21 d、60 d仔鼠皮質(zhì)部位GAP-43光密度與NP暴露劑量呈負相關(guān)(r=-0.711、-0.568，P<0.05)，從縱向比較，各暴露組21 d仔鼠皮質(zhì)GAP-43陽性細胞數(shù)高于60 d(t=1.391，P<0.05,見表1)。

注：A：對照組；B：低劑量組；C：中劑量組；D：高劑量組圖1 NP各劑量組21 d仔鼠皮質(zhì)GAP-43蛋白表達(×200)

注：A：對照組；B：低劑量組；C：中劑量組；D：高劑量組圖2 NP各劑量組60 d仔鼠皮質(zhì)GAP-43蛋白表達(×200)

表1各組仔鼠21 d和60 d皮質(zhì)部位GAP-43蛋白表達

處理組陽性細胞平均數(shù)21d60d積分光密度21d60dA24．75±3．9921．12±3．39190．87±22．07155．75±25．48 B25．50±5．2622．50±3．42189．00±22．03155．25±24．65 C21．25±3．3720．12±3．87170．62±54．91138．00±8．89 D15．37±3．77??15．62±3．96?137．00±22．90?106．37±10．32? F9．8485．2544．42511．898 P0．0050．0000．0110．000

注：方差分析：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

GAP-43廣泛的分布神經(jīng)系統(tǒng)中，參與神經(jīng)元發(fā)育、再生、LTP形成。正常大鼠腦內(nèi)許多區(qū)域有GAP-43免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元[7]。GAP-43一般在出生后1周達到表達高峰，隨著年齡增加而逐步下降，大部分腦區(qū)GAP-43表達水平很低，而皮質(zhì)部GAP-43一直保持在較高水平[8]。本研究結(jié)果與文獻報道的一致，結(jié)果顯示，對照組仔鼠在出生后21 d直到60 d，大腦皮質(zhì)部位均可見GAP-43免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元。相對斷乳期來說，雖然成熟期GAP-43免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)減少、光密度值較小，但仍然有表達，說明從斷乳期到成熟期，仔鼠腦組織中的GAP-43在仍然發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和遞質(zhì)釋放等作用。

目前未見NP對神經(jīng)生長相關(guān)蛋白GAP-43影響的研究，因此，為了從神經(jīng)生長相關(guān)營養(yǎng)因子這個角度，有更多的實驗數(shù)據(jù)證實NP的神經(jīng)毒性，進一步探索NP對神經(jīng)系統(tǒng)特別是子代神經(jīng)系統(tǒng)的毒性機制，本部分實驗觀察和檢測了在神經(jīng)元生長發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶等過程中發(fā)揮重要作用的神經(jīng)生長相關(guān)蛋白GAP-43的蛋白表達，結(jié)果表明，孕期NP暴露后, 從斷乳期到兒童期，仔鼠腦組織皮質(zhì)部GAP-43表達受抑制，高劑量組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且GAP-43的表達與NP暴露劑量呈負相關(guān)，縱向比較發(fā)現(xiàn)，仔鼠成熟期的GAP-43蛋白及mRNA表達較斷乳期少。

綜合以上實驗研究結(jié)果推測，大鼠孕期NP暴露后，有可能通過抑制GAP-43的表達，進一步干擾GAP-43參與的神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育的多個環(huán)節(jié)，包括干擾信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸可塑性、Ca2+信號傳遞和磷脂代謝以及單胺類遞質(zhì)釋放等，進而影響神經(jīng)系統(tǒng)的各項生理功能，損傷子代的學(xué)習(xí)記憶。這種損害可以一直持續(xù)到成年期，即使停止NP暴露，仔鼠的腦海馬區(qū)和皮質(zhì)部GAP-43表達量仍然未能恢復(fù)到對照組水平，其學(xué)習(xí)記憶能力也不能完全恢復(fù)。

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