高曉晨，劉 冬，白俊武，于江波，趙娜娜，宗 穎，崔麗娜，張 輝*，孫佳明*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117;2.吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，吉林 敦化 133700)

哈蟆油(Ranaeoviductus)為我國(guó)常用中藥材，具有補(bǔ)腎益精，養(yǎng)陰潤(rùn)肺的作用。據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版1部記載其來(lái)源為蛙科動(dòng)物中國(guó)林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)雌蛙的輸卵管，經(jīng)采制干燥而得[1]。中國(guó)林蛙是中國(guó)東北長(zhǎng)白山特有的珍稀野生動(dòng)物。分布于遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、河北、山東、山西、陜西、河南、青海、四川等地[2]。黑龍江林蛙，主要分布于黑龍江、吉林、遼寧等省[2]。目前，哈蟆油基原物種的鑒定方法主要為依據(jù)理化性狀、顯微特征等傳統(tǒng)鑒別方法[3]。但這些方法主要以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，不僅受到遺傳因素的影響，而且與中國(guó)林蛙的生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)發(fā)育階段有密切的關(guān)系。在鑒別過(guò)程中穩(wěn)定性較差，影響鑒定結(jié)果[4]?？梢?jiàn)，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)及理化性質(zhì)鑒定難度大，現(xiàn)需要一種準(zhǔn)確有效的方法來(lái)鑒定。 DNA條形碼(DNA Barcoding)是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)短序列來(lái)進(jìn)行物種鑒定的分子診斷新技術(shù)[5]，由加拿大動(dòng)物學(xué)家Hebert等[6]首次提出。近年來(lái)該技術(shù)在物種鑒定方面有廣泛的應(yīng)用和迅速的發(fā)展，并且DNA條形碼技術(shù)簡(jiǎn)便高效,不受樣品的形態(tài)性狀以及研究者的專(zhuān)業(yè)水平限制，可有效的鑒定中藥材[7]。本研究對(duì)哈蟆油基原物種進(jìn)行COI序列研究，分析其藥材的物種變異,建立哈蟆油基原物種DNA分子鑒定方法,為其鑒定提供有效的手段。

1 材料與方法

1.1 材料 共收集樣本12份，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為中國(guó)林蛙和黑龍江林蛙。其中中國(guó)林蛙7份，采自吉林汪清(標(biāo)本號(hào)SJM-RTC-1102)、黑龍江牡丹江(標(biāo)本號(hào)SJM-RTC-1103)、遼寧新賓(標(biāo)本號(hào)SJM-RTC-1105)、內(nèi)蒙古通遼(標(biāo)本號(hào)SJM-RTC-1106)、山東青島膠南區(qū)(標(biāo)本號(hào)SJM-RTC-1107)、山東青島嶗山區(qū)(標(biāo)本號(hào)SJM-RTC-1108)。黑龍江林蛙5份，采自吉林集安(標(biāo)本號(hào)SJM-RA-1101)、黑龍江五常(標(biāo)本號(hào)SJM-RA-1104)、遼寧新賓(標(biāo)本號(hào)SJM-RA-1105)、內(nèi)蒙古通遼(標(biāo)本號(hào)SJM-RA-1106)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 用滅菌后的手術(shù)剪把樣品(哈蟆油或肌肉組織)剪成小塊,取30 mg樣品，用液氮研碎后，使用動(dòng)物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.)提取總DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及電泳 擴(kuò)增引物為COI序列通用引物:正向?yàn)長(zhǎng)CO1490 5’-GGTCAACAAATCATAAAGA-

TATTGG-3’，反向?yàn)镠CO2198 5’-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’[8]。PCR反應(yīng)體積為20 μL，體系內(nèi)含Taq Master Mix 10 μL，引物對(duì)各1.0 μL(2.5 mol/L)、雙蒸水7 μL、DNA提取液1 μL(約30 ng)[9]。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃，1 min；94 ℃，1 min，45 ℃，1.5 min，72 ℃，1.5 min，5 cycles；94 ℃，1 min，50 ℃，1.5 min，72 ℃，1 min，35 cycles；72 ℃，5 min[10]。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，上4 μL的PCR產(chǎn)物，條件為135 V電壓20 min。DL2000 Marker從上至下為2 000、1 000、750、500、250和100 bp(Takara公司)。結(jié)果，實(shí)驗(yàn)樣品在500～750 bp間出現(xiàn)亮帶，條帶清晰，DNA擴(kuò)增成功，進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用ABI 3730XL測(cè)序儀(華大基因公司)雙向測(cè)序。測(cè)序后得到正反兩向峰圖,利用Codon Code Aligner V4.2.7(Codon Code Co.)校對(duì)拼接,去除引物區(qū)，獲得長(zhǎng)度為658 bp的樣品序列。對(duì)于從Genbank獲得的COI序列，采用Codon Code Aligner V4.2.7軟件，與拼接好的樣品序列比對(duì)后，去除與樣品序列相對(duì)應(yīng)的658 bp以外的區(qū)段，最后保留長(zhǎng)度≥550 bp的網(wǎng)上序列。將所有序列用MEGA(Molecular evolutionary genetics analysis)6.0軟件比對(duì)并進(jìn)行遺傳距離等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈蟆油基原物種DNA提取與PCR擴(kuò)增 用COI序列對(duì)哈蟆油基原物種樣品進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)樣本均可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增并成功測(cè)序，瓊脂糖凝膠電泳得到PCR擴(kuò)增電泳圖，擴(kuò)增效果良好，條帶較亮，無(wú)拖尾現(xiàn)象。

2.2 哈蟆油基原物種的種內(nèi)變異

2.2.1 中國(guó)林蛙 中國(guó)林蛙12條序列比對(duì)后序列長(zhǎng)度為662 bp,GC含量為47.7%～49.9%，平均GC含量49.0%。種內(nèi)平均K2P距離為0.042，種內(nèi)最大K2P距離為0.058。有34個(gè)堿基變異位點(diǎn)，其中346位點(diǎn)既有A-G變異又有A-T、T-G變異，見(jiàn)表1。

表1 中國(guó)林蛙種內(nèi)堿基變異情況表

2.2.2 黑龍江林蛙 黑龍江林蛙8條序列比對(duì)后序列長(zhǎng)度為658 bp，GC含量為45.2%～46.1%，平均GC含量45.8%。

有2個(gè)堿基變異位點(diǎn)分別為169位點(diǎn)的C-A變異和499位點(diǎn)的C-T變異。種內(nèi)平均K2P距離為0.003，種內(nèi)最大K2P距離為0.005。

2.3 物種鑒定結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后得到正反向峰圖,采用CodonCode Aligner V2.06校對(duì)拼接獲得長(zhǎng)度為658 bp的樣品序列，原始圖譜為清晰的單峰圖譜，干擾信息低于正常信號(hào)的10%。樣品序列經(jīng)BLAST比對(duì)，為基原物種。

3 討論

目前，DNA條形碼已成為物種鑒定和分類(lèi)研究的熱點(diǎn)[7,11]。COI序列通用性高[12]，操作不當(dāng)，可能會(huì)將異源污染的COI序列擴(kuò)增出來(lái)，因此在DNA提取樣時(shí)要進(jìn)行表面清潔，以避免異源污染對(duì)樣品鑒定的影響。在DNA提取過(guò)程中發(fā)現(xiàn),若完全按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作，得到的DNA含量低。筆者結(jié)合本實(shí)驗(yàn)情況對(duì)操作流程進(jìn)行如下改良:1)適當(dāng)延長(zhǎng)水浴時(shí)間，有利于樣品細(xì)胞消化，重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明56 ℃水浴2 h效果最好。2)動(dòng)物肌肉組織蛋白質(zhì)含量較多,影響樣品DNA的提取效果，故加入氯仿-異戊醇(24∶1)抽提2次，每次10 min，除去溶液中的蛋白質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用改良后的試劑盒，對(duì)哈蟆油基原物種進(jìn)行DNA提取,COI序列引物及PCR擴(kuò)增，獲得哈蟆油基原物種序列。由結(jié)果可知:所建立的哈蟆油基原物種DNA分子鑒定方法可靠、穩(wěn)定，為其鑒定提供有效的手段。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典：1部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:147.

[2]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:421.

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