黃朝忠，劉 智，蘇 穎，胡亞男

(長春中醫(yī)藥大學，長春 130117)

目前絕大多數(shù)腫瘤患者依然采用術(shù)后放化療治療，但是放化療在取得臨床療效的同時其毒副作用越來越嚴重的影響術(shù)后的整體治療與康復，尤其是對機體的免疫功能產(chǎn)生嚴重的破壞，因此，在臨床當中采取有效的預防治療措施降低其毒副作用顯得尤為重要，引起人們的廣泛關(guān)注[1]。隨著中醫(yī)藥在臨床治療腫瘤過程中的嘗試與運用，尤其是在提高放化療患者免疫力方面，已經(jīng)受到醫(yī)學領域的重視[2]。本研究從臨床實際出發(fā)，采用氣血相生的加味當歸補血湯，通過對小鼠外周血、淋巴細胞增殖程度、G-CSF活性的檢測，觀察加味當歸補血湯對經(jīng)環(huán)磷酰胺(CY)抑制的免疫功能低下荷瘤小鼠所具有的免疫功能重建作用，證明中醫(yī)藥可正向調(diào)節(jié)機體免疫功能，并為篩選出最佳的治療劑量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物采用昆明種小鼠，體質(zhì)量(18±2)g，雌雄各半，由吉林大學實驗動物中心提供，合格編號為SCXX(吉)-2011-0004。加味當歸補血湯根據(jù)藥典調(diào)配，按湯劑常規(guī)煎藥2次后混合藥液,濃縮成浸膏冰箱備用。中藥飲片由長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院提供。環(huán)磷酰胺：每支200 mg，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號04090321。G-CSF試劑盒為武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗分組與給藥 60只清潔型昆明小鼠隨機分為空白對照組、腫瘤組、環(huán)磷酰胺干預治療模型組、加味當歸補血湯高、中、低劑量治療組，每組10只，雌雄各半。動物室室溫在18～21 ℃,相對濕度在40%～60%，光照每日12 h，動物可自由進食飲水，實驗環(huán)境符合GB 1495-94國家標準。除空白對照組外其余各組進行H22肝癌腹水瘤的接種。加味當歸補血湯給藥第8天開始對模型組、加味當歸補血湯高、中、低治療組進行小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg[3]，隔日注射。中藥灌服組小鼠按劑量分別灌胃給藥，給藥劑量按照小鼠臨床等效計算所得，空白組、腫瘤組與模型組同時灌服生理鹽水，連續(xù)14 d，給藥組按體積為30 mL/kg體質(zhì)量，1次/d灌服。中藥灌服第8天開始空白對照組和腫瘤組小鼠注射等體積的生理鹽水，其余各組小鼠按80 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺，隔日注射1次，共注射3次。

1.3 實驗方法 小鼠RBC、WBC、Hb水平的測定：將昆明小鼠于第14天末次給藥20 h后小鼠眼球取血，加入EDTA-Na2抗凝劑抗凝，用全自動血細胞分析儀測定計數(shù)情況。

1.4 粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的測定 將昆明小鼠眼球取血，置于2 500 r/min離心機上，離心40 min后分離血清，放置-25 ℃冰箱保存,用ELISA法檢測小鼠外周血G-CSF活性。

1.5 淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗 末次給藥20 h后眼球取血脫頸處死,置于75%乙醇溶液中浸泡，無菌條件下取小鼠脾臟研磨,以3 mL Hank's液將脾細胞沖入無菌平皿中，覆蓋16層紗布于細胞懸液上，過濾吸出細胞懸液離心洗滌1 000 r/min 15min，棄掉上清液加入3 mL完全1640營養(yǎng)液，調(diào)整脾細胞懸液1×106個/mL，取細胞懸液100 μL/mL加入96孔板并加入濃度為10 μg/mL的ConA 100 μL/mL(終濃度為5 mg/mL)同時設置ConA對照孔及空白對照孔，平行3復孔。將96孔細胞培養(yǎng)板置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育68 h，培養(yǎng)終止前4 h每孔加入濃度為5 mg/mL MTT 10 μL繼續(xù)37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后800 r/min離心10 min棄上清液150 μL，每孔加入有機溶劑甲基亞砜(DMSO)100 μL及甘氨酸緩沖液20 μL，570 nm處酶標儀上測定OD值。

2 實驗結(jié)果

2.1 加味當歸補血湯對荷瘤小鼠紅、白細胞水平及血紅蛋白水平的影響 見表1。

表1 治療后各組紅、白細胞和血紅蛋白水平的表達

注：與空白對照組比較，##P<0.01；與腫瘤組比較，△△P<0.01；與模型組相比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

由表1可知,腫瘤組與空白對照組相比較紅細胞、白細胞、血紅蛋白水平降低(P<0.01)，表明荷瘤小鼠癌細胞接種成功。與腫瘤組相比較環(huán)磷酰胺干預治療模型鼠的紅細胞、白細胞、血紅蛋白水平顯著下降(P<0.01)，提示環(huán)磷酰胺造模成功。與模型組相比較，加味當歸補血湯聯(lián)合CY治療的小鼠紅細胞、白細胞、血紅蛋白水平升高(P<0.05)，尤以加味當歸補血湯中劑量組的白細胞水平顯著的升高(P<0.01)，由此說明加味當歸補血湯可使荷瘤小鼠CY化療后紅細胞、白細胞、血紅蛋白水平回升，尤以中劑量效果最佳。

2.2 對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響(MTT法) 見表2。

表2 治療后各組淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能的表達

注：與空白對照組比較，##P<0.01；與腫瘤組比較，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

由表2可知，腫瘤組與空白組相比較P<0.01,提示荷瘤接種成功。模型組與腫瘤組相比較P<0.01，證明環(huán)磷酰胺干預治療造模成功。加味當歸補血湯高劑量組與模型組相比較P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。中、低劑量與模型組相比較P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義，由此說明加味當歸補血湯中、低劑量可以促進淋巴細胞的增殖。

2.3 對小鼠粒細胞集落刺激因子的影響 見表3。

組 別數(shù)值空白對照組 16.406 6±0.562 65 腫瘤組 13.079 0±0.330 81##腫瘤CY組(模型組) 9.953 0±0.623 47△△高劑量治療組 19.005 4±0.536 41▲ 中劑量治療組 17.966 9±0.477 52▲▲低劑量治療組 15.960 9±0.489 88▲

注：與空白對照組比較，##P<0.01；與腫瘤組比較，△△P<0.01；與模型組相比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

由表3可知，腫瘤組與空白組相比較P<0.01,得知荷瘤接種成功。模型組與腫瘤組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，得知環(huán)磷酰胺干預治療模型成功。加味當歸補血湯的高、中、低劑量治療組與模型組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.05)，說明加味當歸補血湯對小鼠的G-SCF活性具有明顯的刺激回升，3組之間相比較得知中劑量效果最好，證明加味當歸補血湯能夠提高荷瘤小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺化療后的G-SCF活性，增強免疫力。

3 討論

環(huán)磷酰胺(CY)是目前臨床上廣泛運用于治療惡性腫瘤的烷化劑抗腫瘤藥物，由于CY屬于非特異性的烷化劑[3]，對腫瘤細胞和正常細胞無選擇性的都具有殺滅的能力,因此在取得療效的同時不可避免的帶來了毒副作用，對全身多種組織器官造成殺傷尤以骨髓抑制更為明顯。其中G-CSF水平下降可能是由于CY化療后對機體的損傷造成的，G-CSF活性的降低可能與白細胞減少和骨髓抑制有關(guān)[4]。近年來,實驗表明G-CSF對腫瘤化療后引起的白細胞減少具有預防的作用,能夠很大程度上改善化療后白細胞下降的幅度[5]。

近年來紅細胞與白細胞一樣在免疫學研究方面已經(jīng)成為不可忽視的免疫細胞，紅細胞不僅具有識別、殺傷抗原與清除免疫復合物的作用而且還參與細胞因子網(wǎng)絡的調(diào)控[6]。因此本研究采用荷瘤小鼠為研究對象,選用環(huán)磷酰胺干預治療為實驗模型，小鼠的RBC、WBC、Hb水平和G-CSF活性指標較正常小鼠和腫瘤組小鼠均下降,說明小鼠的免疫功能已處于抑制狀態(tài)。腹腔注射CY并灌服加味當歸補血湯的小鼠RBC、WBC水平、G-CSF活性較模型組有明顯的改善提高，證明加味當歸補血湯能改善或恢復機體的免疫功能。

加味當歸補血湯由黃芪、當歸、靈芝、阿膠、川芎等藥物組成。方中黃芪為君藥，具有增強自然殺傷細胞殺傷腫瘤細胞的能力[7],可強體抗癌，提高機體的免疫力。臣藥用當歸，與黃芪相輔相成,具有改善血供減輕炎癥反應時的損傷[8]。阿膠大劑量使用能夠提高骨髓的造血功能，促進健康人的淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力，通過補血提高體弱人群的免疫力，迅速補充疾病過程中消耗的氣血陰液,提高免疫力，是不可缺少的治療藥物[9]。靈芝和川芎均可提高機體免疫力，達到防癌抗癌的目的，全方共奏氣血相生之功。實驗表明加味當歸補血湯對小鼠免疫功能具有一定的恢復和增強作用，因此加味當歸補血湯可以作為臨床治療腫瘤疾病過程中放化療的輔助藥物[10]。

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[2]李寶鴻,廉南.加味當歸補血湯對腫瘤患者放化療增效減毒作用的臨床觀察[J].成都中醫(yī)藥大學學報,2005(2):7-9.

[3]蘇穎,郭焱,朱娜.益氣方干預化療所致免疫功能低下作用機理的研究[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志,2010,12(12):1116-1117.

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[6]郭焱,蘇穎,顧紅纓.運用益氣方調(diào)節(jié)化療所致紅細胞減少癥的作用機理研究[J].山西中醫(yī)學院學報,2010,11(5):14.

[7]陳新謙,金有豫.新編藥物學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:716.

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[9]蘇穎,郭焱,劉智.益氣方對化療所致小鼠免疫功能影響的實驗研究[J].長春中醫(yī)藥大學學報,2011,27(1):3-4.

[10]郭焱,蘇穎,朱娜.益氣加減方對化療所致紅白細胞減少癥及免疫功能的影響[J].吉林中醫(yī)藥,2010,30(9):806-807.