蒲寶嬋，李愛主，方 玲

(天津中醫(yī)藥大學，天津 300193)

近年來，原發(fā)性痛經發(fā)病率逐年升高，臨床上開始用經前3～7 d給藥來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的生理周期用藥[1-3]，且以連續(xù)治療3個月經周期為1療程[4-5]。本文根據這一臨床治療方法，在前期工作基礎上[6-7]，通過動物實驗來觀察不同時機給藥對原發(fā)性痛經模型小鼠雌激素受體(ER-α)和縮宮素受體(OTR)表達的影響。

1 實驗材料

經前3劑止痛方JQF(當歸、益母草、川芎、赤芍、桂枝)，購自天津?？滇t(yī)院，并經生藥學鑒定；元胡止痛片，天津同仁堂集團股份有限公司(30 mg/片)。給藥劑量均參考了臨床用藥劑量，并根據體表面積折算成小鼠每日給藥劑量所得。KM小鼠，雌性未孕，18～22 g，SPF級，購自北京華阜康實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證:SCXK(京)2013-0004。苯甲酸雌二醇注射液，寧波市三生藥業(yè)有限公司(2 mL∶4 mg，生產批號：120904)；縮宮素注射液，上海禾豐制藥有限公司(1 mL∶10 u，生產批號:130115)。OTR和ER-α均購自北京博奧森生物技術有限公司，RT-PCR 試劑盒，美國Promega公司；BCA蛋白定量試劑盒，碧云天生物技術公司；凝膠成像分析儀(Cuene Genins)；實時定量PCR儀(Linegene9620)，杭州博日科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 造模與給藥 60只小鼠按體質量分層隨機分為JQF整個動情周期給藥組(以下簡稱JQF動情周期給藥組)、JQF每個周期的第4天給藥組(以下簡稱JQF第4天給藥組)、元胡止痛片組、模型組和正常組，每組12只。根據小鼠動情周期天數[8]，將造模時間定為6 d，除正常組外各組小鼠每日皮下注射苯甲酸雌二醇0.2 mg/只。JQF動情周期給藥組(0.218 g/kg)和元胡止痛片組(0.1 g/kg)每日灌胃給以相應藥物(0.2 mL/10 g)，連續(xù)6 d,JQF第4天給藥組(0.218 g/kg)小鼠每個周期的第4天開始給藥至周期結束(共3 d)，正常組和模型組每日灌胃相應體積的生理鹽水。待6 d造模給藥結束后，從各組中隨機抽取6只小鼠檢測1周期給藥治療對ER-α和OTR表達的影響，剩余小鼠按上述方法連續(xù)造模給藥18 d(3個周期)后，再檢測3周期連續(xù)給藥治療后的實驗結果。

2.2 取材 動物處死后，立即開腹暴露子宮，將子宮周圍脂肪和系膜剝離干凈，按左右位置分為兩段取出子宮，使子宮內組織液流出，用濾紙吸凈后稱重，取同只同位段子宮組織用錫紙包裹，放- 80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 Western blot檢測ER-α和OTR蛋白的表達 用含有蛋白酶抑制劑混合物的裂解液提取子宮組織中的蛋白，根據蛋白含量檢測試劑盒說明進行蛋白質定量。取10 μL蛋白在5%濃縮膠、10%分離膠的SDS-PAGE凝膠上樣，經過電泳、轉膜后4 ℃過夜保存，孵育相應一抗。取出后于室溫下用TBST清洗5次，每次5 min。室溫下孵育二抗1 h，再次洗滌后進行ECL曝光，應用Bio imaging system圖像處理系統(tǒng)分析條帶光密度值。

2.4 Real-time PCR檢測ER-α和OTR mRNA的表達 ER-α和OTR引物序列如下：OTR:sense:5’ GAT GTC GCT CGA CCG CTG TCT 3’;anti-sense:5’ CGC CCA GCA ATC GAA GAC TCC 3’(172 bp);ER-α:Sense:5’ CAC ACC AAA GCC TCG GGA ATG 3’，anti-sense:5’ TAG TTG AAC ACA GTG GGC TTG 3’(146 bp);β-actin:sense:5’ TCA GGT CAT CAC TAT CGG CAA 3’;anti-sense:5’A GC ACT GTG TTG GCA TAG AGG 3’(169 bp)。用變性緩沖液(Trizol)一步法提取子宮組織中的總RNA，按試劑盒說明逆轉錄為cDNA,在預變性95 ℃ 10 min，變性94 ℃ 20 s，退火延伸59 ℃ 20 s，共40個循環(huán)的反應條件下完成基因的擴增。用2—△△Ct來表示每個目的基因的相對表達量[9]。

3 實驗結果

3.1 ER-α和OTR蛋白的表達情況 從圖1和圖2中可以看出,正常組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較，JQF第4天給藥組、JQF動情周期給藥組和元胡止痛片組1周期給藥治療后小鼠子宮組織中ER-α、OTR蛋白的表達顯著降低(P<0.01),且第4天給藥組和動情周期給藥組組間比較無差異。從圖中也可以看出，3周期連續(xù)造模給藥實驗結果與1周期一致，且對ER-α和OTR蛋白表達的抑制作用更加顯著。

3.2 ER-α和OTR mRNA的表達情況 從圖3和圖4中可以看出，正常組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較,JQF第4天給藥組和JQF動情周期給藥組1周期給藥治療后小鼠子宮組織中ER-α、OTR mRNA的表達顯著降低(P<0.01)，且2組組間比較無差異，3周期連續(xù)造模給藥實驗結果與1周期一致。元胡止痛片組給藥后ER-α mRNA的表達1周期實驗結果與3周期一致，均呈顯著性降低(P<0.01)，而OTR mRNA的表達1周期給藥治療后明顯降低(P<0.05)，3周期連續(xù)造模給藥后結果顯著(P<0.01)。

Z：正常組；H：JQF第4天給藥組；Q：JQF動情周期給藥組；Y：元胡止痛片組；M：模型組。**表示與模型組比較,P<0.01。圖1

Z：正常組；H：JQF第4天給藥組；Q：JQF動情周期給藥組；Y：元胡止痛片組；M：模型組。**表示與模型組比較,P<0.01。圖2

Z：正常組；H：JQF第4天給藥組；Q：JQF動情周期給藥組；Y：元胡止痛片組；M：模型組。**表示與模型組比較,P<0.01。圖3

Z：正常組；H：JQF第4天給藥組；Q:JQF動情周期給藥組；Y：元胡止痛片組；M：模型組。**表示與模型組比較,P<0.01。圖4

4 討論

經前3劑止痛方(JQF)是臨床治療原發(fā)性痛經的有效方劑，在前期研究結果中發(fā)現在患者的黃體退化期用藥治療效果更為顯著[10]。本研究根據這一結果提示，選取相當于人體黃體退化期的雌性小鼠動情周期后3 d用藥[8](即從每個周期的第4天開始給藥)作為另一給藥時機,與整個動情周期用藥作比較來觀察這兩組不同時機給藥對原發(fā)性痛經模型小鼠子宮組織中ER-α和OTR表達的影響。

現代研究認為，原發(fā)性痛經的發(fā)生主要是由于雌激素(E2)和縮宮素(OT)水平的異常升高，所導致的子宮痙攣性收縮、缺血而引起的[11]。E2的生物學效應強弱與靶細胞內雌激素受體(ER)的水平密切相關[12]。ER-α作為ER的主要亞型之一，在子宮中起主導作用，可以通過對子宮蠕動的調節(jié)來改變子宮收縮強度,以減輕痛經程度。OT與OTR結合后可以通過作用于子宮平滑肌細胞，引起子宮收縮而致痛，還可通過引發(fā)子宮小動脈持久而強烈的收縮，使子宮肌層組織缺血而致痛[13]，所以痛經程度的大小與OTR 的表達密切相關。 實驗結果顯示，小鼠原發(fā)性痛經模型復制成功，實驗結果有效。與模型組比較,JQF周期的第4天給藥與整個動情周期給藥均可以顯著抑制ER-α和OTR蛋白、mRNA的表達,3周期連續(xù)造模給藥與1周期結果一致，且兩組組間比較均無差異，說明周期的第4天給藥與整個動情周期給藥對原發(fā)性痛經模型小鼠ER-α和OTR蛋白、mRNA具有相同的治療作用，且3個周期連續(xù)造模給藥后結果依然有效，從動物實驗初步體現了臨床上月經來潮前開始用藥與整個生理周期用藥治療原發(fā)性痛經具有相同的治療效果。

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